Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

이 프로시저의 전반적인 목표는 생체 내 이미징을 통해 종양으로의 나노입자 섭취량을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 조류 배아의 껍질을 제거하고 배양함으로써 수행됩니다. 다음 단계로 융모막 양막 또는 CAM에 이종 이식 종양을 형성하고, 약 1주일 동안 성장시킵니다.

절차의 세 번째 단계는 나노입자를 정맥 주사하고 이식된 종양의 실시간 생체 내 공초점 이미징을 수행하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 종양을 적출하고 절편을 만드는 것입니다. 최종적으로, 이미지로부터 종양의 나노입자 섭취량을 정량화하며 추가적인 종양 분석을 수행할 수 있습니다.

기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 미세 수준에서 종양 내 나노입자 축적의 역학을 평가할 수 있는 고해상도 이미지를 생성할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 모델 시스템을 이용하면 단일 연구자가 2주 이내에 매우 많은 수의 실험군을 분석하는 것이 가능합니다. 아울러, Shells 배아의 Cory Alloid 막은 물리적 조작과 비침습적 이미징을 위해 쉽게 접근할 수 있습니다.

본 연구실은 암의 표적 분자 영상 및 약물 전달을 위한 나노입자 개발에 집중하고 있습니다. 상세한 섭취 분석을 수행할 수 있는 빠르고 저렴한 제노그라프트 모델을 찾는 과정에서 저희는 쉘스(shells) 닭 배아 모델을 도입하게 되었습니다. 본 영상에서는 수정된 쉘스 닭 배아 모델 내 인간 종양 제노그라프트의 나노입자 섭취를 평가하기 위해 고해상도 생체 내 영상 기술을 사용합니다.

본 프로토콜을 위해, 4일 차의 수정된 닭 배아를 준비하여 껍질을 제거하십시오. 표준 방법을 사용하여 심장 박동을 확인함으로써 배아가 수정되었고 생존 가능한지 확인하고, 배아 발달 9일 차까지 38 °C, 상대 습도 60% 이상의 조건에서 배양하십시오. 이후 배아는 종양 세포 접종 준비가 완료됩니다.

18 gauge 바늘을 5~6인치 길이의 tigon 튜브를 사용하여 1mL 시린지에 연결하여 마이크로 인젝터를 조립합니다. 바늘의 베벨 부분을 튜브 안에 조심스럽게 삽입합니다. 바늘 끝에서 약 4~5인치의 튜브가 연장되어 있어야 합니다.

이제 튜브를 통해 종양 세포 현탁액을 시린지로 끌어당긴 후 뒤집습니다. 시린지 옆면을 조심스럽게 두드리고 플런저를 눌러 기포를 제거합니다. 다음으로 튜브 끝에 미세주입 유리 바늘을 삽입하고, 세포 현탁액이 바늘 끝에 도달할 때까지 플런저를 누릅니다.

이제 해부 현미경 하에서 10,000~100,000개의 암세포를 CAM 내부의 간질 공간에 천천히 그리고 주의 깊게 주입합니다. 세포는 CAM 내에서 육안으로 확인 가능한 볼루스(bolus) 형태를 형성해야 하며, CAM 표면에 묻은 세포는 킴와이프(kim wipe)나 면봉으로 가볍게 닦아내어 제거할 수 있습니다. 이제 배아를 38 °C, 습도 60% 이상의 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

종양이 성장하고 혈관이 형성되도록 최대 7일간 대기하여, 나노입자 이미징 전에 종양의 직경이 최소 5mm에 도달하도록 합니다. 나노입자는 생체 내 현미경(intravital microscope)과 호환되는 형광 염료로 표지하여 4°C의 PBS에 보관하며, 이 상태에서 최소 1년 동안 안정적으로 유지됩니다. 그 다음, 마이크로 인젝터로 흡입하기 전에 나노입자를 1분간 원심 분리하여 응집물을 펠릿화합니다. 이제 PBS를 사용하여 나노입자를 희석하여 1mg/mL의 작동 농도로 준비하며, 최종적으로 50µL의 부피에 50µg의 나노입자를 주입합니다.

이제 배아 발달 16일 차에 주입을 진행하십시오. 정맥 내로 가장 적합한 종양 보유 배아를 선택하기 위해 종양에 혈관 형성이 충분히 이루어졌는지 확인합니다. 종양 세포 및 나노입자와 분광학적으로 구별되는 저분자량 형광 덱스트린을 주입하십시오.

그 후 형광 현미경으로 덱스트린을 시각화하고, 혈관 형성이 가장 활발한 종양을 가진 배아를 선택합니다. 배아가 선택되면, 준비된 마이크로 인젝터를 사용하여 준비된 나노입자를 최소 200 microliters 주입합니다. 시린지를 반전시킵니다.

측면을 조심스럽게 두드리고 플런저를 눌러 기포를 제거합니다. 이제, 끝이 가늘어지는 긴 유리 미세주입 바늘을 튜브 끝에 삽입하고 나노입자 용액이 바늘 끝에 도달할 때까지 플런저를 누릅니다. 뭉툭한 바늘은 외배엽을 뚫지 못하며, 너무 날카롭고 가는 바늘은 조직에 삽입할 때 부러질 수 있습니다.

다음으로, 나노입자를 주입한 직후 시각화하려는 반대편 원위부의 배아에 30에서 200 µL의 나노입자를 정맥 주사합니다. 다음 섹션에서 설명할 종양 분석을 위해 먼저 배아 이미징 장치를 준비합니다. 우선, 뚜껑 하단에 있는 이미징 포트의 둘레를 따라 진공 그리스를 얇게 도포합니다.

그런 다음 18 millimeter 유리 커버슬립을 포트에 장착합니다. 이제 커버슬립이 이미징하려는 대상 영역 위에 오도록 배아를 장치에 로드합니다. 커버슬립이 배아에 살짝 닿을 때까지 장치의 덮개를 천천히 내린 후 덮개를 돌려 고정합니다.

이제 배아가 들어 있는 디시를 37 °C의 물이 채워진 이미징 유닛에 넣습니다. 이 유닛은 스피닝 디스크 공초점 형광 현미경의 스피닝 디스크 공초점 현미경 아래에서 배아를 고정하는 역할을 합니다. 환경 챔버의 온도가 37 °C인지 확인하십시오.

이제 커버슬립 창이 현미경 대물렌즈 바로 아래에 오도록 이미징 유닛을 스테이지 위에 배치하고 이미징을 진행하십시오. 주입 직후와 이후 1시간 간격으로 종양 및 주변 혈관 구조의 고해상도 이미지 스택을 획득하십시오.

그 후, 영상에는 종양 혈관에서 일어나는 상세한 구조적 변화가 반영될 것입니다. 배아는 워터 배스를 교체할 필요 없이 최대 36시간 동안 연속적으로 촬영할 수 있습니다. 영상에서 바이러스 나노입자의 섭취량을 정량화하려면 velocity와 같은 소프트웨어 패키지를 사용하십시오.

먼저 종양을 선택하고 주변 기질과 구분합니다. 형광 덱스트린으로 종양을 표지하면 선택 과정이 용이해집니다. 이제 종양 내의 나노입자와 인접 기질의 대표 영역에서 평균 형광 신호를 계산합니다.

다음으로, 평균 신호의 비율을 계산합니다. 평균 신호에 대해 종양 선택(tumor selection)을 강화합니다. 기질 선택(stromal selection)을 강화합니다.

비율이 1보다 크면 나노입자가 종양에 우선적으로 국소화되었음을 나타냅니다. 9일 차의 닭 배아 융모막(cam) 내에 직경 약 1mm의 덩어리를 형성하도록 HT 29 결장암 세포를 주입하였습니다. 7일간 배양한 닭 배아에 저분자량 덱스트린을 정맥 주입하여 종양 혈관 형성을 확인하였습니다.

CPMV LOR 6 47 또는 페길화된(pegylated) CPMV LOR 6 47 나노입자를 정맥 투여한 후 고해상도 실시간 공초점 이미징을 통해 분석한 결과, CPMV와 페길화된 CPMV 나노입자 모두 전체 혈관계를 빠르게 표지하는 것으로 나타났습니다. 주입 후 12시간 이내에 종양 부위와 기질 부위의 형광 신호를 정량화한 결과, 페길화된 CPMV의 종양 내 섭취량이 CPMV보다 약 3배 더 높았습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 조류 배아 준비부터 종양 세포의 이종 이식, 나노입자의 정맥 주입, 그리고 실시간 생체 내 공초점 이미징을 통한 종양 내 나노입자 섭취 평가에 이르기까지, 조류 배아 모델에서 종양 이종 이식물 내 나노입자 섭취를 평가하기 위한 고해상도 생체 내 이미징 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.