CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 갓 채취한 마우스 조직에서 적혈구 전구세포를 직접 식별하는 것입니다. 이를 통해 마우스의 적혈구 생성 시스템이 변화하는 시기의 분자적 특성을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 배아 발달 단계나 저산소 스트레스 반응 중에 먼저 마우스의 태아 간 또는 성체 비장이나 골수에서 조혈 조직을 분리하고, 이를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

다음으로 세포 표면 마커인 CD 71 및 TER 119와 관심 있는 다른 마커(예: 세포 생존율 또는 세포 주기 상태 측정용)에 대한 항체로 세포를 표지합니다. 이후 표지된 세포 현탁액을 유세포 분석기로 분석하여 성숙 단계가 서로 다른 특정 적혈구모세포 하위 집단을 식별합니다. 이러한 특정 하위 집단은 세포 분류(cell sorting)를 통해 정제할 수 있습니다. 이어서 각 적혈구모세포 성숙 하위 집단에 대해 세포 및 분자 분석을 수행할 수 있습니다.

갓 분리한 조혈 조직에서 특정 성숙 단계의 적아구를 직접 식별할 수 있는 능력은 생리적 피질 상태의 세포를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 방법은 서로 다른 성숙 단계의 고위 적아구가 생체 내에서 어떻게 반응하는지 연구할 수 있게 해줍니다. 마우스가 자극을 받으면 적혈구 생성 속도가 가속화됩니다.

예를 들어, 고산 지대를 모방한 저산소 조건이나 에리스로포이에틴(erythropoietin) 호르몬의 주입 등이 있습니다. 우리는 다중 파라미터 유세포 분석법을 사용하여 복잡한 조직 환경 내에서 적혈구모세포(blasts)를 식별하고, 이들의 신호 전달, 생존 및 세포 주기 상태를 동시에 연구합니다. 또한 신선한 조직에서 특정 성숙 단계의 적혈구모세포를 직접 분리하여 유전자 발현 수준, 염색질 상태 또는 기타 분자적 기능을 탐구할 수 있습니다.

마우스의 최종 적혈구 생성은 성체 마우스의 비장과 골수에서 일어납니다. 따라서 안락사시킨 마우스로부터 해당 조직들을 채취해야 합니다. 마우스를 안락사시킨 후, 심장 천자를 통해 EDTA 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 혈액을 채취하며, 이 혈액은 이후 헤마토크릿 측정, 망상적혈구 수 측정 또는 CBC 분석에 사용됩니다.

수확한 비장과 대퇴골을 차가운 염색 완충액(staining Buffer)이 들어 있는 각각의 튜브에 넣습니다. 필요에 따라 수확한 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 비장의 무게를 측정합니다.

적혈구 생성 스트레스 반응을 겪는 생쥐는 비장 무게가 상당히 증가하는 경향을 보입니다. 이후, 이전에 생쥐 배아에서 입증된 절차에 따라 수확한 조직으로부터 비장 세포와 골수 세포를 준비합니다. 확정적 적혈구 생성은 배아기 12.5일에서 15.5일 사이에 태아 간에서 일어납니다.

임신 12.5일에서 14.5일 사이의 태아 간 세포를 얻기 위해 임신 시기가 조절된 암컷 마우스를 준비합니다. 임신 시기가 조절된 암컷 마우스를 안락사시키고, 자궁각을 얼음이 담긴 페트리 접시로 옮겨 적출합니다. 차가운 배양 배지 또는 염색 버퍼를 사용합니다.

배아 12.5일 이하의 태아 간을 해부하여 자궁에서 배아를 분리하기 위해서는 해부 현미경이 필요합니다. 먼저 각 배아를 자궁각(horn)에서 분리하십시오. 그런 다음 자궁벽을 조심스럽게 절개하여 양막낭 안에 있는 배아를 꺼냅니다.

양막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 태아 간은 훨씬 작은 심장 아래에 위치한 가장 큰 붉은색 복부 조직입니다. 태아 간을 적출하려면, 핀셋을 사용하여 간의 양옆에서 배아를 고정하고 간을 복부 밖으로 밀어내어 배지로 옮깁니다.

간을 신선한 염색 완충액이 담긴 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 태아 간의 해부가 끝나고 신선한 염색 완충액이 담긴 튜브로 옮겨졌다면, 피펫팅을 통해 간을 기계적으로 분리합니다. 그 다음, 분리된 세포를 40 micron 나일론 메쉬 스크린으로 여과하고, 원심분리를 통해 세포를 두 번 세척하며, 이때 상층액은 버리고 염색 완충액으로 다시 현탁합니다.

두 번째 세척 후, 세포를 trypan blue로 염색하고 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 수를 측정합니다. E 13.5의 태아 간에는 약 10⁷개의 세포가 있습니다. 유세포 분석을 위해 세포를 샘플당 200 µL에 1~2 × 10⁶개의 세포가 되도록 재현탁합니다.

본 비디오 프로토콜에서는 유세포 분석을 위한 항체 염색 과정을 태아 간 세포만을 대상으로하여 시연합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 마우스 세포의 FC 수용체 차단을 위한 정제된 rabbit IgG, CD 71 FETR one 19 PE 및 세포 표면 단백질 fast를 표적으로 하는 항체를 포함하는 1차 항체 염색 프리믹스를 준비합니다. 튜브를 2~3회 반전시켜 항체 용액을 부드럽게 혼합한 후, 이전에 준비한 태아 간 세포 샘플에 1차 항체 염색 프리믹스 200 µL를 첨가하고 피펫팅을 부드럽게 하여 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 6개의 대조군 세포 샘플을 준비합니다. 세포의 배경 자가형광을 확인하기 위해 염색 완충액에 그대로 둔 미염색 샘플, 채널 간의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 프로토콜에 사용된 각 항체 또는 색상별로 준비한 단일 색상 샘플(본 실험에서는 TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin 및 streptavidin A PC), 그리고 fast biotin의 실제 배경값을 제공하는 fluorescence minus one 대조군(프로토콜의 fast biotin을 제외한 모든 색상 또는 항체로 세포를 염색한 샘플)을 준비합니다. 샘플과 관련 대조군을 1차 항체 염색액에 넣고 얼음 위 암소에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면, 각 샘플 튜브에 염색 완충액 3 mL를 추가하여 세포를 세척하고 4 °C에서 약 400 ×g로 3~5분간 원심 분리합니다. 다음으로, PC 내에 strep avid를 적용하고 튜브를 얼음 위에서 30~45분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 첫 번째 항체 염색 때와 동일하게 세포를 세척합니다.

마지막으로, 사멸 세포를 제외하기 위해 세포 투과성이 없는 DNA 염료인 seven a a d가 포함된 염색 용액에 세포를 재부유합니다. 이제 샘플을 유세포 분석기에 분석할 준비가 되었습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 적혈구모세포 아집단을 안정적으로 식별할 수 있도록 유세포 분석 이벤트의 게이팅 분석을 정확하게 수행하는 것입니다.

정확한 대조군 샘플을 이용한 세심한 기기 설정, 스펙트럼 중첩에 대한 정밀한 보정, 그리고 죽은 세포, 응집체 및 매우 작은 이벤트들을 제외하는 후속 게이팅 과정이 필요합니다. 데이터 분석 시작 단계에서, 무염색 샘플과 단일 색상 대조군 샘플을 사용하여 각 색상 조합의 스펙트럼 중첩 보정을 설정합니다.

이 예제에서는 FITC 형광이 PE 채널로 어떻게 유입되는지, 그리고 보정 후 이러한 스펙트럼 중첩이 어떻게 교정되는지를 보여드리겠습니다. 먼저, 염색되지 않은 대조군을 사용하여 FITC 양성 및 PE 음성 영역을 정의합니다. 다음으로, FITC 단색 대조군을 사용하여 PE 채널로의 스펙트럼 유입을 시각화할 수 있습니다.

FlowJo 소프트웨어를 이용한 디지털 보정 후, PE 채널의 spillover fit E 신호를 최소화합니다. 보정이 완료되면 사멸 세포, 응집체 및 작은 이벤트들을 제거할 수 있습니다. 응집체와 세포 이중항(doublet)은 전방 산란광(forward scatter) 높이 대 전방 산란광 면적을 도식화하고 좁은 대각선 게이트 내의 이벤트들을 선택함으로써 제거합니다.

세포 비투과성 DNA 염색약인 DAPI에 대해 음성인 세포를 선택하여 사멸 세포를 제거합니다. DAPI 음성 생존 세포 게이트는 전방 산란광(forward scatter)이 매우 낮은 핵이나 데브리스와 같은 매우 작은 이벤트 또한 배제합니다. 다음으로, 태아 간세포의 게이팅 전략을 보여드리겠습니다.

갓 수확한 세포를 CD 71 TUR one 19 및 비 적혈구 계통 마커를 표적으로 하는 ZI 표지 항체 칵테일로 라벨링했습니다. 본 예시에서는 샘플의 스펙트럼 중첩에 대한 보정이 이미 완료되었으며, 응집체, 사멸 세포 및 매우 작은 이벤트들을 제외하기 위해 게이팅을 수행한 상태입니다. 계통 양성 fitzy 염색을 제외한 모든 색상이 포함된 FMO 샘플을 사용하여 fitzy 히스토그램을 작성하고 계통 음성 세포 게이트를 정의합니다. 다음으로, 이 게이트를 ZI 접합 계통 마커로 염색한 태아 간 세포 샘플에 적용합니다.

Lineage 음성 세포를 선택하여 Y축에 CD 71, X축에 TER 119를 설정하여 도식화합니다. 이제 X축을 기준으로 세포를 S0에서 S5까지의 하위 집단으로 나눌 준비가 되었습니다. Lin 결핍 S0 하위 집단은 주로 EPO 의존성이 시작되기 전의 CFUE 잠재력을 가진 세포들을 포함합니다.

S1 서브셋은 주로 세포 주기 S-기에 있는 EPO 의존성 CFUE 세포를 포함합니다. S2 서브셋 세포는 군집 형성 능력을 상실하고 헤모글로빈을 발현하기 시작합니다. S3 서브셋 세포는 주로 염기성 에리스트로블라스트(basophilic erythroblasts)이며, S4 및 S5 서브셋은 후기 에리스트로블라스트를 포함합니다. 여기에는 CD 71 및 TER 119, 그리고 사망 수용체 Fas를 표적으로 하는 항체로 처리 및 표지된 비장 세포의 데이터 획득 후 분석 전략이 제시되어 있습니다.

하나는 획득한 모든 이벤트를 보여주며, 여기서 대각선 게이트는 더블렛이나 더 큰 응집체를 제외하고 단일 세포일 가능성이 높은 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트 내의 세포들은 여기의 히스토그램 2에서 추가로 분석됩니다. 핵이나 파편일 가능성이 높은 매우 작은 이벤트들은 제외됩니다.

게이트가 지정된 세포들은 히스토그램 3에 표시되어 있으며, 여기에서 막 투과성이 있는 세포 사멸 세포일 가능성이 높은 DAPI 양성 세포들은 추가 분석에서 제외되었습니다. 히스토그램 4는 그 결과로 얻은 생존 비장 세포 집단을 보여줍니다. pro eGate에는 CD 71 high TER 1 19 Intermediate 세포들이 포함되어 있으며, R 1 19 high 세포들은 히스토그램 5에서 추가로 분석됩니다.

여기서 CD 71 고발현 세포는 덜 성숙한 넓은 영역인 A 적혈구모세포와 더 작고 성숙한 B 적혈구모세포로 세분됩니다. 가장 성숙한 적혈구모세포 하위 집단은 C입니다. TER 19 및 CD 71과 동시에 해당 항체들을 추가함으로써 이러한 각 하위 집단에 대한 세포 표면 단백질의 발현을 동시에 측정할 수 있습니다. 염색 히스토그램 6은 기저 상태의 생쥐와 Epo를 단회 투여한 생쥐에서 특히 A 하위 집단의 데스 수용체 Fas의 세포 표면 발현을 보여줍니다.

결과는 EPO가 해당 영역에서 fast 발현을 억제함을 나타냅니다. 각 서브셋에 속한 세포들에 대해 세포 내 단백질의 in vivo 발현이나 세포 주기 상태를 측정할 수도 있습니다. 이 대표적인 세포 주기 분석에서, 마우스의 복강 내에 BRDU를 주입하고 30분에서 60분 후에 골수를 채취하였습니다.

CD 71 및 TER one 19 염색 외에도, 복제 중인 DNA에 BRDU가 삽입된 세포를 염색하였습니다. BRDU 양성 세포는 세포 주기의 S기에 해당합니다. 간기 세포는 BRDU 음성이며 G1기 또는 G2/M기로 구분될 수 있습니다. DNAD seven A A D를 사용하여 PRO E 영역 A A B 및 A EC 하위 집합 각각에서 세포를 분류할 수 있습니다.

여기서 사이토신 표본을 통해 세포 크기의 감소, 핵 응축, 그리고 헤모글로빈 발현을 반영하는 갈색 착색의 증가와 함께 순차적인 성숙 과정이 나타나 있습니다. 마지막으로, E 13.5 태아 간의 S3 서브셋에 대한 대표적인 세포 주기 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 임신한 마우스에 BRDU를 주입하였습니다.

태아 간을 적출하고 30~60분 후 고정, 투과화 및 CD 71, TER one 19, BRDU에 대한 항체로 염색하였습니다. S-phase 세포가 BRDU 양성인 것을 통해 S3 세포의 세포 주기 상태를 분석하며, DNA 염료인 seven A a d로 염색하여 DNA 함량을 정량화합니다.

본 연구에서 설명하는 사이토메트리 접근 방식은 세포 표면 마커 및 기타 단백질의 발현, 인산화 특이적 항체를 이용한 세포 생존 및 세포 신호 전달, 그리고 세포 주기 상태와 같은 세포 기능을 동시에 조사할 수 있게 해줍니다. 따라서 이를 통해 다양한 자극에 대한 적혈구모세포(서로 다른 성숙 단계)의 분자적 반응이나 유전자 돌연변이의 영향을 조사할 수 있습니다. 유세포 분석을 통한 성숙 하위 집단은 세포 표면 마커 발현과 전방 산란광(forward scatter)을 기준으로 정의된다는 점에 유의해야 합니다.

일반적으로 각 서브셋의 세포는 다양한 마우스 모델에서 유사한 형태학적 적혈구모세포 단계에 해당한다는 것을 확인하였습니다. 하지만 새로운 마우스 모델을 조사할 때는 이를 검증하는 것을 권장합니다. 각 서브셋의 세포를 분리하여 형태를 관찰함으로써 이를 확인할 수 있습니다. 또한, RNA 또는 전사체 분석을 위해 각 서브셋의 세포를 분리할 수 있으며, 분리 실험 시에는 세포에 가해지는 전단 응력을 최소화하기 위해 낮은 분리 압력과 넓은 노즐을 사용하십시오.

또한 각 소팅 실험 후 세포의 순도와 생존율을 확인하는 것을 권장합니다. 마지막으로, 특정 서브셋의 빈도 변화가 감지되었을 때, 이것이 해당 서브셋 내 세포 수의 실제 변화로 인한 것인지 아니면 다른 서브셋의 변화로 인한 것인지 판단하는 것이 중요합니다. 따라서 서브셋 빈도를 측정하는 것 외에도, 각 서브셋의 절대 세포 수를 항상 함께 측정해야 합니다.