CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 생쥐의 갓 수확한 조직에서 적혈구 전구체를 직접 식별하는 것입니다. 이를 통해 우리는 이 쥐의 적혈구 형성 시스템이 변화를 겪는 동안 분자 특성을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 배아 발달 중 또는 저산소 스트레스에 대한 반응 중에 첫 번째 조혈 조직은 마우스 태아 간 또는 성인 비장 또는 골수에서 분리되어 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다.

다음으로 세포를 세포 표면 마커 CD 71 및 TER one 19에 대한 항체로 표지하고, 예를 들어 세포 생존 또는 세포주기 상태를 측정하기 위해 다른 관심 마커와 함께 유세포 분석기를 사용하여 표지된 세포 현탁액을 분석한 다음 뚜렷한 성숙 단계에서 특정 적혈구 아세포 subset을 식별합니다. 이러한 특정 subset은 세포 분류에 의해 정제될 수 있습니다. 그 후, 각 적혈구 성숙 부분 집합에 대해 세포 및 분자 분석을 수행할 수 있습니다.

갓 분리된 조혈 조직에서 직접 특정 성숙 단계의 적혈구를 식별할 수 있는 능력은 생리학적 피질의 세포를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 방법을 사용하면 다양한 성숙 단계의 높은 적혈구 세포를 연구하고 in vivo에 반응할 수 있습니다. 생쥐가 자극을 받으면 적혈구 형성 상자를 가속화합니다.

예를 들어, 높은 고도 또는 에리트로포이에틴 호르몬의 주입을 모방한 저산소 상태가 있습니다. 당사는 다중 파라미터 유세포 분석을 사용하여 복잡한 조직 환경 내에서 블랫을 식별하고 동시에 신호 생존 및 세포주기 상태를 연구합니다. 또한 적혈구의 특정 성숙 단계를 신선한 조직에서 직접 분류하고 유전자 발현 수준, 염색질 상태 또는 기타 분자 기능을 탐색할 수 있습니다.

Mouse definitive erythropoiesis는 성체 마우스의 비장과 골수에서 발생합니다. 따라서 이러한 조직은 안락사된 쥐에서 채취됩니다. 심장 천자로 쥐를 안락사시킨 후 EDTA 또는 헤파린 혈액 채취 튜브에 혈액을 채취한 후 이 혈액은 나중에 헤마토크릿 수, 망상적혈구 수 또는 CBC 분석에 사용됩니다.

채취한 비장과 대퇴골을 냉염색이 들어있는 별도의 튜브에 넣습니다. 완충기. 원하는 경우 수확한 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 비장의 무게를 잰다.

적혈구 스트레스 반응을 겪는 마우스는 비장 무게가 크게 증가할 가능성이 있습니다. 그 후, 비장 세포와 골수 세포는 이전에 마우스 배아에서 입증된 절차에 의해 수확된 조직으로부터 제조됩니다. 결정적 적혈구증은 배아 12.5일과 15.5일 사이에 태아의 간에서 일어납니다.

시간 제한 임신 암컷 마우스는 임신 12.5일에서 14.5일에 태아 간 세포를 얻을 준비를 합니다. 시간이 지정된 임신한 암컷 쥐는 안락사시키고 자궁 뿔을 얼음이 들어 있는 페트리 접시로 제거합니다. 저온 배양 배지 또는 염색 완충액.

궁에서 배아를 제거하기 위해 배아 12.5일 이하의 태아 간을 절제하려면 해부 현미경이 필요합니다. 먼저 각 구슬을 뿔에서 분리합니다. 그런 다음 자궁 벽을 부드럽게 절제하여 양막 안에 있는 배아를 방출합니다.

양막을 부드럽게 떼어냅니다. 태아의 간은 훨씬 더 작은 심장 아래에 위치한 가장 큰 붉은 복부 조직입니다. 태아의 간을 절개하려면 겸자를 사용하여 간 양쪽에 있는 배아를 고정시키고 간을 복부에서 배지로 부드럽게 밀어 넣습니다.

새로운 염색 완충액이 들어 있는 튜브로 간을 부드럽게 옮겼습니다. 모든 후, 태아의 간을 절개하여 새로운 염색이 들어있는 튜브로 옮겼습니다. 완충액은 피펫팅을 통해 간을 기계적으로 해리한 다음 40미크론 나일론 메쉬 스크린을 통해 해리된 세포를 여과하고 원심분리로 세포를 두 번 세척하여 염색 완충액에 현탁하는 상등액과 재생을 버립니다.

두 번째 세척 후 세포를 트리안 블루로 염색하고 혈류 세포 분석기를 사용하여 계산합니다. E 13.5의 태아 간에는 약 10에서 7번째 간이 있습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 200 마이크로리터 샘플당 1-2배 10에서 6번째 세포로 세포를 재현탁합니다.

이 비디오 프로토콜의 목적을 위해 유세포 분석을 위한 항체 염색은 태아 간 세포에서만 시연됩니다. 이 절차를 시작하기 위해, 마우스 세포의 FC 수용체를 차단하기 위한 다음과 같은 정제된 토끼 IgG IgG 및 세포 표면 단백질을 빠르게 향하는 항체를 포함하는 1차 항체 염색 프리믹스를 준비합니다. 튜브를 2-3회 뒤집어 항체 용액을 부드럽게 혼합하고, 미리 준비된 태아 간 세포 샘플에 미리 혼합된 1차 항체 염색 200마이크로리터를 첨가하고 피펫을 위아래로 부드럽게 하여 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 이 6개의 대조군 세포 샘플을 준비합니다. 세포의 배경 자가형광을 제공하기 위해 세포를 염색 완충액에 남겨둔 염색되지 않은 샘플, 채널 간의 스펙트럼 중복을 보정하기 위해 프로토콜에 사용되는 각 항체 또는 색상에 대한 단일 색상, 이 실험에서는 TUR 1 19 PE CD 71 fz fast, 비오틴 및 스트렙타비딘 A PC 및 7 A A DA 형광에서 빠른 비오틴에 대한 1 대조군을 뺀 값, 이는 세포가 fast biotin을 제외한 프로토콜의 모든 색상 또는 항체로 염색되는 채널에 대한 진정한 배경을 제공합니다. 1차 항체 염색 부위의 샘플과 관련 대조군을 어두운 곳에서 45분에서 1시간 동안 얼음 위에서 배양합니다.

배양이 끝나면 각 샘플 튜브에 3ml의 염색 완충액을 추가하여 세포를 세척하고 섭씨 4도에서 약 400배 중력으로 3-5분 동안 회전합니다. 다음으로, PC에 연쇄상구균 avid를 바르고 얼음 위에서 30-45분 동안 튜브를 배양합니다. 배양이 완료되면 첫 번째 항체 염색과 같이 세포를 세척합니다.

마지막으로, 세포 불침투성을 함유하는 염색 용액에 세포를 재현탁시키고, DNA 염료 7 a a d 를 사용하여 죽은 세포를 배제합니다. 이제 샘플은 유세포 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 유세포 분석 이벤트의 정확한 게이팅 분석을 통해 적혈구 아세포 부분 집합을 신뢰할 수 있게 식별하는 것입니다.

모든 올바른 제어 샘플을 신중하게 기계로 설정하고, 스펙트럼 중복에 대한 신중한 보상과 데드 셀, 응집체 및 매우 작은 이벤트를 제외하는 후속 게이팅이 필요합니다. 데이터 분석을 시작할 때. 염색되지 않은 샘플과 단일 색상 제어 샘플은 각 색상 조합에 대한 스펙트럼 중복에 대한 보상을 설정하는 데 사용됩니다.

이 예에서는 fit e 형광이 PE 채널로 어떻게 흘러 들어가는지, 그리고 보정 후 이 스펙트럼 중첩이 어떻게 수정되는지 보여줍니다. 먼저, 염색되지 않은 대조군을 사용하여 적합 E 양성 및 PE 음성 영역을 정의합니다. 다음으로, fit E 단일 색상 제어를 사용하여 PE 채널로의 스펙트럼 스필오버를 시각화할 수 있습니다.

FlowJo 소프트웨어를 사용한 디지털 보정에 따라 PE 채널의 스필오버 핏 E 신호가 최소화됩니다. 일단 보상된 죽은 세포, 응집체 및 작은 이벤트를 제거할 수 있습니다. 응집체 및 셀 이중선은 전방 산란 높이 대 전방 산란 영역을 플로팅하고 좁은 대각선 게이트 내에서 이벤트를 선택하여 제거됩니다.

죽은 세포는 dapi A 세포 불침투성 DNA 다이에 대해 음성인 세포를 선택하여 제거합니다. DAPI 음성 생존 세포 게이트는 또한 매우 낮은 전방 산란을 가진 핵 또는 파편과 같은 매우 작은 이벤트를 제외합니다. 다음으로 태아 간 세포에 대한 게이팅 전략을 보여 드리겠습니다.

갓 수확한 세포는 CD 71 TUR one 19에 대해 라벨링되었고, 비 적혈구 계통 마커를 겨냥한 ZI 라벨링 항체 칵테일을 라벨링했습니다. 이 예에서 샘플은 이미 스펙트럼 중복에 대해 보상된 다음 응집체, 데드 셀 및 매우 작은 이벤트를 제외하기 위해 게이트되었습니다. 계통 positive fitzy stain을 제외한 모든 색상을 포함하는 FMO 샘플을 사용하여 fitzy 히스토그램을 플롯하고 계통 negative cell gate를 정의한 다음, 이 gate를 ZI conjugated lineage markers로 염색된 태아 간 세포 샘플에 적용합니다.

계통 음성 세포가 선택되고 Y축에 CD 71 및 TER 1 19로 표시됩니다. 이제 A 축에서 셀을 S 0에서 S 5까지의 하위 집합으로 나눌 준비가 되었습니다. Lin 고갈된 S zero 서브셋은 EPO 의존성이 시작되기 전에 CFUE 전위를 가진 세포를 주로 포함하고 있습니다.

S-one subset은 주로 세포주기의 S-기에 있는 EPO 의존성 CFUE 세포를 포함합니다. S 두 개의 하위 세포는 집락 형성 가능성을 잃고 헤모글로빈을 발현하기 시작하고, S3 하위 세포는 주로 호염성 적혈구 세포이며, S 4 개 및 S 5 개 하위 집합은 후기 적혈구 세포를 포함합니다. 여기에 표시된 것은 CD 71 및 TER one 19에 대한 항체로 처리 및 표지된 비장 세포에서 데이터를 획득하고 사멸 수용체 빠른 히스토그램을 사용한 분석 전략입니다.

하나는 수집된 모든 이벤트를 보여주며, 대각선 게이트는 이중선 또는 더 큰 응집체를 제외한 단일 셀일 가능성이 있는 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트의 세포는 여기 히스토그램 2에서 추가로 분석됩니다. 핵 또는 파편과 같은 매우 작은 이벤트는 제외됩니다.

게이티드 세포는 히스토그램 3에 나타나 있으며, 여기서 막 투과성 세포일 가능성이 있는 DAPI 양성 세포는 추가 분석에서 제외됩니다. 히스토그램 4는 생존 가능한 비장 세포의 결과 집단을 보여줍니다. pro eGate는 CD 71, 높은 TER 1개, 19개의 중간 세포, tur R 1, 19개의 높은 세포를 히스토그램 5로 추가로 분석합니다.

여기서, CD 71 높은 세포는 덜 성숙한 넓은 영역, 적혈구 아세포와 더 작고 더 성숙한 A B 적혈구 아세포로 세분됩니다. 가장 성숙한 적혈구 아세포 하위 집합은 ARI C.이며, 세포 표면 단백질의 발현은 TER R one 19 및 CD 71과 동시에 관련 항체를 첨가하여 이러한 각 하위 집합에 대해 동시에 측정 할 수 있습니다. 염색 히스토그램 6은 사멸 수용체의 세포 표면 발현을 보여주며, 특히 기저 상태의 마우스와 E ppo를 1회 투여한 마우스의 A 하위 집합

결과는 EPO가 해당 영역에서 빠른 발현을 억제한다는 것을 나타냅니다. 세포 내 단백질의 집단 in vivo 발현 또는 세포주기 상태는 또한 각 subset의 세포에 대해 측정될 수 있습니다. 이 대표적인 세포주기 분석에서는 마우스에 BRDU를 복강내에 주입하고 30-60분 후에 골수를 적출했습니다.

CD 71 및 TER one 19에 대해 염색되는 것 외에도, 세포는 주기의 S-기에 있는 복제 D-N-A-B-R-D-U 양성 세포에 BRDU 통합을 위해 염색되었습니다. 계면 셀은 BRDU 음성이며 G 1 또는 G 2 M 상으로 분해될 수 있습니다. DNAD를 사용하여 7개의 A, A, D 셀이 PRO, E, 영역, A, B 및 A, EC 서브셋 각각으로부터 정렬될 수 있다.

여기에서는 세포체 제제에서 세포 크기의 핵 응축이 감소하고 헤모글로빈 발현을 반영하는 갈색 착색이 증가함에 따라 순차적 성숙을 보여줍니다. 마지막으로, E 13.5 태아 간에서 S3 하위 집합의 대표적인 세포주기 분석이 여기에 나와 있습니다. 임신한 마우스에게 BRDU를 주입했습니다.

태아의 간은 30분에서 60분 후에 적출하여 perme를 고정하고 CD 71, TER one 19 및 BRDU에 대한 항체로 염색하였다. S3 세포의 세포주기 상태를 S상 세포가 있는 위치에서 분석합니다. BRDU 양성 및 DNA 함량은 DNA 염료 7 A a d에 대한 염색에 의해 정량화됩니다.

우리가 설명하는 세포 측정 접근법은 세포 표면 마커 및 기타 단백질의 발현, fosso 특이적 항체를 사용한 세포 생존 세포 신호 전달 및 세포주기 상태와 같은 세포 기능을 동시에 조사할 수 있습니다. 따라서 적혈구의 분자 반응, 광범위한 자극에 대한 다른 성숙 단계 또는 유전적 돌연변이의 영향을 조사할 수 있습니다. 유세포 분석 성숙 subset은 cell surface marker expression 및 forward scatter의 관점에서 정의된다는 점에 유의해야 합니다.

우리는 일반적으로 각 하위 집합의 세포가 다양한 마우스 모델에서 유사한 형태학적 적혈구 세포 단계에 해당한다는 것을 발견했습니다. 그러나 새 마우스 모델을 검사할 때 이를 확인하는 것이 좋습니다. 각 하위 집합에서 세포를 분류하고 그 형태를 검사함으로써 각 하위 집합의 세포를 RNA 또는 전사체 분석을 위해 분류할 수도 있으며, 분류 실험은 세포에 가해지는 순전한 스트레스를 최소화하기 위해 낮은 분류 압력과 넓은 코를 사용합니다.

또한 각 분류 실험 후에 세포 순도와 생존율을 확인하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 주어진 하위 집합의 빈도 변화를 감지할 때 이것이 해당 하위 집합의 셀 수의 실제 변화로 인한 것인지 아니면 다른 하위 집합의 변화로 인한 것인지 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 하위 집합 주파수를 측정하는 것 외에도 항상 각 하위 집합에 있는 셀의 절대 수를 측정해야 합니다.