Name: 조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 조류 엠브리오 막(CAM) 모델을 이용한 암 전이 정량 분석 방법입니다. 인간 종양 세포의 전이 능력을 평가하고 정량 PCR로 데이터를 획득하는 기술을 익혀보세요.

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우리는 아낌없이 수정된 난자를 제공 타이슨 식품 주식 회사를 인식 싶어요. 샨나 아놀드는이 프로토콜을 찍는 동안 계기되었다. Trenis 팔머는 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (F31 국립 암 연구소)에서 국립 보건원에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 CCSRI 부여 # 700537 JDL 및 NIH / NCI 부여 # CA120711 - 01A1 및 AZ로 CA120711 - 01A1에 의해 지원되었다.

1. xenografting 위해 달걀 (자발적인 전이)를 준비 <ol><li> 갓 수정된 닭고기 달걀은 10 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다. </li><li> 발달 10 일째에 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다. </li><li> chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 이 정맥은 그것이 몇 가지 큰 혈관의 교차점입​​니다 달걀 껍질의 상단에 위치하고 있습니다. 이 지점 시점에서 혈관은 CAM 멀리 아래로 방울 및 배아에 연결됩니다. 1cm 사각형 상자가 정맥의 분기점에서 약 1cm 떨어진 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다. </li><li> 실리콘 카바이드 숫돌 (Dremel 부분 # 84922) 구멍이 공기 색으로 계란의 뭉툭한 끝 통해 뚫고있다가 장착되어 회전 절삭 도구 (Dremel)를 사용합니다. 이 같은 도구를 사용하여 구멍은 달걀 껍질 막의 짧은 중지, 계란 위에 이전에 그려진 사각형 안에 뚫고있다. 끝에 훌륭한 버와 25 게이지 주사 바늘은 기본 CAM 찢어하지 않도록주의되는 달걀 껍질 막의 작은 구멍을 만드는 데 사용됩니다. CAM은 이후 airsac에있는 구멍에 대한 위치 ¼ "tygon 튜빙의 일부로 장착되어 자동 피펫 에이드로 만든 부드러운 흡입을 사용하여 사각형의 영역에 달걀 껍질 막의 분리이다. 흡입을 적용시, 공기 주머니는 광장에 구멍 아래 CAM이 성공적으로 달걀 껍질에서 멀리 떨어되었음을 나타내는 것입니다. CAM을 떨어뜨린 후, 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 접목의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 2. 정맥 주사에​​ 대한 계란을 준비하는 것은 (실험 전이) <ol><li> 갓 수정된 닭고기 달걀은 12 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다. </li><li> 발달 일 12 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다. </li><li> chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 0.5 cm의 사각형으로 1cm 직접 정맥 위에 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다. </li><li> 작은 창이 Dremmel 드릴 비트를 (# 118)를 사용하여 그려진 위치에 달걀 껍질에 만들어집니다. 창이 이후 미네랄 오일 드롭과 투명 렌더링되는 기본 달걀 껍질 막을 폭로 제거됩니다. 그래픽 묘사에 대한 그림 5A를 참조하십시오. </li><li> 이 시점에서 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 주사의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다. </li></ol> 3. 접목이나 사출에 대한 종양 세포를 준비. <ol><li> 잔여 미디어, 트립신, 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 제거하기 위해 xenografting 들어, 종양 세포는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 그들의 문화 요리로부터 분리되며 인산염의 10 볼륨 세탁 (PBS) 살린 버퍼. </li><li> IV 주입 들어, 교양 세포는 nonenzymatic 셀 분리 솔루션을 사용하여 분리되며, 혈청이없는 DMEM로 세탁. 이상) </li><li> 세포는 hemacytometer로 집계와 접목을 위해 10-40000000 세포 / ML에서 PBS에 resuspended하거나, 또는 IV 주입을위한 1,000,000 세포 / ML에서 혈청없는 DMEM에 resuspended 있습니다. </li></ol> 4. 새로 노출된 CAM (자연 전이)에 종양 세포를 접목 <ol><li> 달걀은 인큐베이터에서 제거하고 작은 창이 새 공기 주머니가 형성되었습니다 이전에 그려진 사각형의 위치에서 절단합니다. 이것은 가장 쉽게 절단 휠 (# 409 원형 절단 휠과 Dremel 도구)이 장착된 회전 도구를 사용하여 이루어집니다. 바늘 코 포셉의 두 사람은 달걀 껍질의 작은 부분을 제거하고 기본 CAM을 폭로하는 데 사용됩니다. </li><li> 목화 - 스쳐 작은 주걱을 (피셔 브랜드 # 23-400-001)를 사용하여 CAM은 5 번 abraded입니다. 약간의 피가 목화에 분명해야합니다. 즉시 CAM을 손상 후 세포 현탁액의 25μl가 손상된 영역에 배치됩니다. 세포의 최적의 숫자가 결정됩니다 Empirically하지만 0.5X10 5 1X10 6 범위하실 수 있습니다. 난자에 창문이 테이프로 단단히 밀봉하고 새끼는 세포가 정착 수 있도록 10~15분에 대해 서 남아 있습니다. 십오분 후 달걀이 정지 인큐베이터에 반환됩니다. </li><li> 종양은 특정 응용 프로그램과 사용하는 종양 세포주의 특성에 따라 5-8일에 대한 성장을 사용할 수 있습니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 5. 종양 세포의 정맥 주사 (실험적 전이) <ol><li> 세포 현탁액의 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100μl 것은 각각의 배아의 allantoic 정맥에 주입, 계란은 고정 인큐베이터에 반환하고 추가 1~7일 거기에 남아 있었다. </li><li> 서로 다른 시간 지점에서, 폐 이하 CAM은 각 배아에서 수확되며 아래에 설명된대로, 종양 세포의 검출을위한 처리. </li></ol> 6. 수확 종양과 여자의 조직 <ol><li> 해부 영역이 준비됩니다. 분석은 매우 민감한 PCR 방식을 사용하여 인간 DNA를 quantifying하여 전이성 세포를 감지합니다. 그것은 외인성 DNA와 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 해부는 전용 지역에서 수행하고 해부를 통해 도구는 각 동물 사이에 청소합니다. 내장을 제거하는 기본 종양과 한 세트를 제거 한 세트를 계란을 절단 한 설정 해부 과정에서 도구의 3 별도의 세트를 사용하여 샘​​플의 교차 오염을 방지하기 위해. 또한, 넷 씻어 용기는 각 동물 간의 도구 rinsing 연속 사용됩니다. 시퀀스에서 이러한 세척은 다음과 같습니다 1) 더블 증류수, 2) 더블 증류수, 3) 염소 표백제, 4) 70 % 에탄올. </li><li> 달걀은 정지 인큐베이터에서 제거하고 동물을 마취 및 안락사에 15 분 동안 얼음에 게재됩니다. 창문은 종양이 표시되고 그러한 열립니다. 달걀 껍질의 일부​​를 제거하여 더 큰 창문을 열면 필요할 수 있습니다. 기본 종양은 CAM에서 resected 무게, 그리고 조직학에 대한 처리됩니다. </li><li> 여자는 동등 반쪽으로 반경 껍데기를 절단하여 달걀 껍질에서 제거됩니다. 배아는 컷 껍질에서 decanted 최대 깨끗한 무게는 보트를 가슴쪽으로 전송됩니다. 동물은 도구의 신선하고 깨끗한 집합을 이용한 해부합니다. 동물은 흉골을 통해 절단에 의해 열립니다. 일단 배아 역시 오른쪽 또는 왼쪽으로 기억 상실증이 수집에서 간장의 일부 열려 있습니다. 내장은 이후 모래 주머니에 연결된 식도에 부드럽게 당기와 기관을 연결 visera를 절단하여 제거됩니다. 폐에 상처 수집하기 위해 흉곽은 가슴 판은 구분 개설되고 마음이 제거됩니다. 이 시점에서 그것은 폐암의 사면 주위에 절단이 가능합니다 (머리에 가까운 가기 흉곽, 호흡 관을 따라 횡경막과 오른쪽 하단을 따라 왼쪽). 일관성을 위해 같은 폐는 각 동물에 수집됩니다. 수확 조직 샘플은 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다 또는 DNA의 격리를 위해 즉시 처리할 수 있습니다. </li></ol> 7. 게놈 DNA의 분리 및 정량 PCR 분석 <ol><li> 게놈 DNA는 Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 (시그마 - 알드리치 카탈로그 # XNATRG)를 사용하여 조직에서 추출됩니다. 추출 DNA는 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송하고 -20 ° C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 이후 PCR 반응에 사용하기 전에 nuclease 무료로 물 속에 DNA 1시 50분을 희석하는 것이 중요합니다. 또는 DNA는 표준 DNA 추출 프로토콜 (Zijlstra 외., 2002)의 번호를 사용하여 추출하실 수 있습니다. </li><li> 인간의 DNA는 인간의 Alu 시퀀스에 대한 정량 PCR의 특정을 사용하여 여자의 조직에서 발견됩니다. 정량 PCR은 Exract - N - 앰프 키트에서 SYBR 녹색 증폭을 사용하여 수행됩니다 Alu 특정 primers를 사용하여. PCR 키트 SYBR 녹색, 버퍼, 솔츠 dNTPS, DNA 형성 촉매 효소 및 Jumpstart는 DNA 형성 촉매 항체를 포함하는 2X 반응 믹스와 함께 제공됩니다. 반응 혼합물은 각 프라이머의 0.4μM와 15μl의 최종 볼륨으로 구성되어 있습니다. 압축을 푼 DNA를 사용하는 대부분의 경우는 1시 50분는 양적 데이터를 제공합니다 희석을 위해, 그러나, 템플릿 DNA의 최적의 금액은 경험적으로 최적화해야 할 수 있습니다. 치킨 GAPDH의 primers는 PCR은 Alu 시퀀스에 대해 다음 조건에서 실행되는 내부 통제으로 사용됩니다 : 95시 효소 활성 ° 95 30 사이클 뒤에 2 분 C ° 30 S., 63를위한 C ° C 30 S. 72 ° 30 C S. 닭고기 GAPDH에 대한 반응 조건은 그러나 40 사이클로 PCR을 확장해야 할 수 있습니다 Alu에 대한 설명들에게 동일합니다. </li><li> 전이의 정량 분석은 제어 그룹 (Schmittgen 및 Livak, 2008 실험 그룹을 비교 ΔΔCt 방법을 사용 수행됩니다;. Zijlstra 외를, 2002). 또는 표준 곡선은 압축을 풉니다 - N - 앰프 키트 (Zijlstra 외., 2002)를 사용하여 압축을 푼 인간의 종양 세포의 희석 계열을 사용하여 생성할 수 있습니다. 통계 중요성은 학생 T - 테스트 또는 제어 및 실험 그룹의 Anova 분석을 사용하여 평가됩니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 닭 배아 전이 모델. 주요 단계에서 단면에있는 모델의 모습을 보여주는 A) 4 패널 다이어그램 : 1. 부화 10 일 후. CAM은 거의 최대 크기에 도달했습니다. 동맥과 정맥은 계란의 상단에 대한 위치 Allantoic 정맥과 별개로 볼 수 있습니다. 2. 바로 달걀 껍질에 구멍을 드릴링 후 달걀 : airsac에 하나 allantoic 정맥에 대한 부착 지점에 인접한 하나. 3. 가벼운 진공 후 외관 airsac을 벗어나 CAM을 드롭하는 데 사용되었습니다. 종양 세포 (파란색)은 떨어졌다 CAM에 적용됩니다. 4. 이식할 종양 세포의 성장 수 있도록 후, 닭 배아의 조직과 함께 종양을 분석 수확 아르 B) 모델의 시리얼 묘사 :. 1. 계란을 잠복기. 2. allantoic 정맥의 위치., 3 마킹. 달걀 껍질에 구멍을 시추. 4. CAM을 떨어진다. 5. 접목 종양 세포., 6 오프닝 커팅. 종양 세포를 적용., 7. 얼음에 계란을 냉각하는 것은 사전에 조직을 수집합니다. 8. 성장 7 일 후 종양을 수확. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 캠 종양의 조직학. 종양 베어링 chorioallantoic 막에서 가져온 조직은 포르말린, sectioned에 고정하고 trichrome 얼룩로 처리되었습니다. CAM의 성장 7 일 이후 A) HEp3 종양. B와 C가 보여주는 종양과 두 기질에서 확대 영역을 보여줍니다. D) normals CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 전이의 정량 분석 세로. 높거나 낮은 전이성 능력 (HEp3 M (하이) 각각 HEp3 M (낮은))으로 머리와 목 암의 HEp3에 대한 변형은 Alu PCR을 사용하여 전파하는 능력에 대해 분석했다. 텐 동물 칠일의 기간 동안 각 시점에서 분석했다. 이 샘플은 # 조직을 cells/50mg 같은 표준 곡선에 대한 계량 및 이후 표현했다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 동물 자연 전이 세포의 억제는 종양의 전이 억제 항체 1A5로 치료. 종양은 일 - 10 태아의 CAM에 적용 5X10 5 HEp3 세포를 사용하여 형성되었습니다. 절반 동물 방지 CD151 항체 1A5 대우 있던 종양 세포를 적용한 후에 3 일. 종양 - 베어링 동물의 폐는 이틀 후에 수확 및 정량 실시간 PCR alu를 받게되었습니다. chGAPDH의 반대로 양적 실시간 PCR은 호스트의 게놈 DNA의 상당 수량 (ΔΔCt 메소드 (양적 두 그룹을 비교하는 B를 사용했다)의 존재를 확인하는 데 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 전이성 폭포에서 체포, 성장, 그리고 intravasation을 평가. 체포, 성장 속도, 그리고 intravasation의 비율 : 기본적으로 보조 기관에 전이는 세 가지 측면의 기여에 의해 정의됩니다. 이들은 실험 전이 (A)와 자발적인 전이 (B)의 조합을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 체포은 세포의 숫자로 정의 실험 전이 (A)를 사용하면 2 시간 게시 주사를 발견했습니다. 체포 세포의 생존과 성장은 휴대폰 번호 이용하려면 포스트 주사의 변화로 결정됩니다. 성장은 3-7 일 동안 확산의 속도로 정의됩니다. Intravasation는 자발적인 전이 (B) 번호 intravasated 전지는 값이 일 6 일 현재 전이성 부담의 성장 예측 초과 일 7 전이성 부담 선물로 정의됩니다 사용 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. CAM에서 전이성의 머릿속으로 확장. GFP를 표현 HEp3 세포 발달 하루 12 정맥 주입했다. 일 1, 3, 5에 달걀이 희생되었고 CAM의 섹션은 형광등 스테레오 현미경으로 몇 군데했다. 진한 녹색 배경이 달걀 껍질에 의해 만들어진, vasculature는 검은색 선으로 표시로 볼 수 있으며, 종양 세포는 밝은 녹색 관광 명소로 볼 수 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

병아리 CAM은 암 생물학과 전이성 진행의 다양한 측면을 연구하기위한 모델 시스템으로 수십 년 동안 사용되었습니다. 전이성 능력 원리 평가는 휴면의 분석을 포함하는 그룹의 다양한하여이 모델에서 수행되었습니다 (. 아귀레 Ghiso 외, 1999; Ossowski과 제국, 1983), 조직 개조 (Deryugina 외, 2005;. 안 - Dantona . 외, 1999), 그리고 전이 (Zijlstra 외, 2008;. Zijlstra 외, 2002).. 그것은 사용하기 때문입니다 자사의 용이성, xenografts를 수락하기 위해 능력의 암 생물학을위한 매우 매력적인 모델을 계속하며, 저렴한 비용 (챔버 외, 1982;. 챔버 외, 1990).. 인간의 구체적인 Alu 기반의 정량 PCR (.. 김 외, 1998; Zijlstra 외, 2002)를 사용하여 우리는 인간 cpiderm...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산 버퍼 살린 (D - PBS) (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> 산도 7.4 </td></tr><tr><td> 트립신, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4Na와 0.05 % (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> 스포츠먼 해처 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> 이러한 incubators는 가장 쉽게 사용할 수 몇 가지 있습니다. 그러나 비디오는 다른 장비를 보여줍니다. </td></tr><tr><td> 스포츠먼 인큐베이터 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel 회전 공구 </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 더 Dremel 커토프 바퀴 없습니다. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> 휴대용 피펫 에이드 </td><td> 어부 </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> 커튼 Applicators를 스쳐 </td><td> 어부 </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> 수정된 계란 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 여러 공급 업체가 사용할 수 있습니다. 계란은 약 35-55그램해야합니다. 그들이 나이 36 사이 55주해야 낳는 암탉. </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 현미경 조명기 </td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 게이지 바늘 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

전이 암 세포가 일차 종양에서 보급하는 동안, 주위 조직으로 침범하고, 멀리 떨어진 장기로 확산. 전이는 많은 조직 유형, 기간 변수 기간을 포함하고 자주 어려운 조사 수치 만들기, 장기 이내 깊은 발생할 수 복잡한 과정이다. 또한, 전이성 프로세스의 효능이 어려운 종양 세포 행동의 단일 측면의 기여를 평가하는 전이성 폭포의 여러 단계에 의해 영향을받습니다. 그 결과, 전이의 assays 자주 전이를 공부하는 반드시 현실 컨텍스트를 제공하기 위해 실험 동물에서 수행됩니다. 불행히도,이 모델은 더 이상 자신의 복잡한 생리학에 의해 복잡하게됩니다. 여자의 난자는 chorioallantoic 멤브레인 (CAM), 종양 세포의 xenografting에 수용되는 달걀 껍질 아래에있는 잘 vascularized 엑스트라 배아 조직의 접근으로 인해, 전이를 공부하는 많은 한계를 극복 생체내 모델에서 독특한 (그림 1). 또한, 여자는 배아가 자연스럽게 immunodeficient이기 때문에, CAM은 쉽게 정상과 종양 조직 모두의 engraftment을 지원합니다. 가장 중요한 조류 CAM 성공적으로 성장, 침공, angiogenesis, 그리고 microenvironment의 개조를 포함하여 대부분의 암 세포 특성을 지원합니다. 이것은 암 전이로 이어질 가능성과 새로운 치료제로 전이성 암의 반응​​을 예측하는 경로의 조사를 위해 모델이 매우 유용합니다. 종 특정 Alu PCR에 의해 전파 세포의 검출은 양적 25 세포처럼 몇 가지에 의해 식민지 아르 장기 전이를 평가하는 것이 가능합니다. 인간 표피 암종 세포 라인 (HEp3)를 사용하여 우리는 여자의 간, 폐를 포함하여 먼 장기에 암 세포의 자발적인 전이를 분석이 모델을 사용합니다. 또한, Alu - PCR 프로토콜을 사용 우리는 전이의 개별 요소 intravasation, 체포, 넘쳐 흐름, 그리고 식민을 분석하고 quantitate하는 도구로 감도와 분석의 재현성을 보여줍니다.

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

전이 과정에서 암세포는 원발성 종양으로부터 분산되어 주변 조직으로 침습하고 원격 장기로 퍼져 나갑니다. 전이는 복잡한...

본 절차의 전반적인 목표는 닭의 장액성 막(chorioallantoic membrane, CAM)을 이종이식 모델로 사용하여 암세포의 전이 능력을 정량적으로 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수정란을 CAM이 성숙할 때까지 배양합니다. 절차의 두 번째 단계는 종양 세포를 CAM에 정맥 주사하거나 국소적으로 이종이식하는 것입니다.실험적으로 정의된 시간 간격 후에 분석을 위해 조직을 수집한 다음, 인간 대립유전자 서열에 대한 인간 특이적 PCR을 사용하여 전이를 정량화하고 그 결과를 분석합니다. 제 이름은 Trent Palmer이며, Andre Zilstra 박사 연구실의 대학원생입니다.저는 제노그라프트 및 자발적 전이 모델을 시연할 예정이며, 저의 멘토이신 Dr. Zilstra께서 정맥 주사와 실험적 전이 모델을 시연하실 것입니다. 기존 모델과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실험자가 정량적으로 연구할 수 있는 신속성과 용이성입니다. 인간 종양 세포의 전이를 연구함으로써 실험자는 약 120마리의 동물을 설정하고 2주라는 기간 내에 프로토콜의 시작부터 끝까지 완료할 수 있습니다.병아리 배아의 접근성이 뛰어나고 조작이 용이하기 때문에, 이 시스템은 다양한 X ovo 응용 분야로 쉽게 확장될 수 있습니다. 당사는 지난 몇 년간 이를 수행해 왔으며, 이는 추가적인 JoVE vertical의 주제가 되었습니다. 갓 낳은 수정란은 회전식 인큐베이터에서 시간당 4회씩 10일 동안 배양합니다.10일째 되는 날, 달걀 랙(egg rack)을 이용하여 알을 옆으로 눕히고, 기실(air sock)이 있는 알의 뭉툭한 끝부분의 껍질에 강한 직사광원을 비춥니다. 이제 배아 혈관(choic vein)의 분지점을 찾습니다. 알을 장축 기준으로 20도 이내로 회전시키면 분지점을 가장 쉽게 식별할 수 있습니다.혈관이 껍질에서 떨어지는 지점을 시각화하기 위해, 심장 정맥의 분지점에서 1 cm 떨어진 곳에 1 cm 크기의 정사각형 상자를 그립니다. 그런 다음 요오드에 적신 면봉으로 상자 주변 영역을 세척합니다. 실리콘 카바이드 연마석을 장착한 드레멜을 사용하여, 먼저 달걀의 둔단에서 기낭까지 구멍을 뚫고, 이어서 정사각형 내부의 난각막 직전까지 구멍을 뚫습니다.이제 끝부분에 미세한 버(burr)가 있는 25 gauge 바늘을 조심스럽게 사용하여 달걀껍데기 막을 뒤로 잡아당깁니다. 올바르게 수행하면 하단의 캄(cam)이 찢어지지 않고 하단 막에서 분리됩니다. 1/4인치 tigon 튜브가 장착된 자동 피펫 에이드를 사용하십시오.기낭 구멍에 가벼운 흡입력을 가하여 사각형 아래에 공기 주머니가 형성되었는지 확인하면 성공 여부를 알 수 있습니다. 난각막을 파쇄하는 동안 캠이 손상되면 캔이 명확하게 떨어지지 않습니다. 알을 회전시키며 기낭을 흡입할 때, 껍질 바로 아래에 보이는 공기가 손상된 캠 내부와 그 아래로 끌어당겨지게 됩니다.캠이 떨어진 후에는 이 달걀들을 사용할 수 없습니다. 실험용 테이프로 두 구멍을 모두 막고 달걀을 정지형 배양기에 넣으십시오. 이제 달걀은 이종이식 준비가 완료되었습니다.제노그라프트(xenograft)를 위해 종양 세포를 준비하는 것으로 시작합니다. 먼저, trypsin EDTA를 사용하여 배양 접시에서 세포를 분리합니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)로 세포 밀도를 측정하고, PBS에 10~40 million cells/mL 농도로 재부유시켜 세포 준비를 마칩니다.이제 에탄올로 후드와 드레멜 툴을 멸균한 후, 인큐베이터에서 알을 꺼냅니다. 알껍질 상단에 창을 내고, 면봉을 사용하여 손상된 부위를 5회 정도 가볍게 닦아내어 면봉에 약간의 혈흔이 묻어 나오게 합니다. 즉시 0.5~1백만 개의 세포가 포함된 세포 현탁액 25 µL를 주입합니다.이제 실험용 테이프로 창을 밀봉하고 세포가 가라앉을 때까지 10~15분 동안 둡니다. 15분 후, 알을 고정식 인큐베이터로 옮겨 종양이 5~8일 동안 성장하도록 합니다. 섹션 2에서 설명한 것과 동일한 배양 방법을 사용하여 12일 된 알을 수집합니다.광원 앞에 알을 배치하여 코리 정맥(corry vein)과 토익 정맥(toic vein)의 위치를 찾고, 정맥 바로 윗부분을 표시합니다. 1 cm x 0.5 cm 크기의 사각형 영역을 설정하고, 요오드에 적신 면봉으로 해당 부위를 깨끗이 닦아냅니다. 이제 드릴 비트가 장착된 드레멜(dremel)을 사용하여 사각형 영역의 달걀 껍데기에 작은 창을 만듭니다.난각 창을 조심스럽게 제거하여 아래의 막이 드러나게 합니다. 노출된 막에 미네랄 오일을 한 방울 가하여 투명하게 만듭니다. 인큐베이터에서 알을 꺼내고 30게이지 인슐린 주사기를 사용합니다.각 배아의 auic 정맥에 세포 현탁액 100 µL를 주입합니다. 그런 다음 노출된 막 위에 실험용 테이프를 붙이고, 이후 1~7일 동안 알을 정지식 배양기에 넣습니다. 다음 섹션에서 설명하는 바와 같이 종양 세포 검출을 위해 폐 또는 하부 cam을 적출합니다.이 절차의 단계는 해부를 위해 전용으로 지정된 구역에서 수행해야 하며, DNA와의 접촉 가능성을 절대적으로 최소화하는 것이 중요합니다. 시료 간의 교차 오염을 방지하기 위해, 해부를 시작하기 전과 각 해부 과정 사이에 난자 절단, 원발성 종양 제거, 내부 장기 제거에 사용할 세 가지의 서로 다른 도구 세트를 사용하십시오. 각 도구 세트는 표백제로 한 번, 70% ethanol로 한 번, 그리고 2차 증류수로 두 번 세척하십시오.알을 정지형 인큐베이터에서 꺼내어 15분 동안 얼음 위에 둡니다. 동물을 마취 및 안락사시키기 위해, 종양의 모습이 보이도록 창을 엽니다. 종양을 완전히 노출시키기 위해 창의 크기를 더 넓혀야 할 수도 있습니다.이제 CAM에서 원발성 종양을 절제하십시오. 깨끗한 도구 세트를 사용하여 종양의 무게를 측정하고 조직학적 분석을 위해 처리합니다. 다음으로, 장기 적출을 진행하십시오.먼저 달걀 껍질에서 병아리를 꺼냅니다. 이를 위해 껍질을 방사형으로 균등하게 이등분하여 절개합니다. 그런 다음 절개된 틈을 통해 병아리 배아를 조심스럽게 쏟아내어 꺼냅니다.또한 펀칭 도구를 사용하여 난각 양측에서 각 2조각의 칼집(cam)을 채취하여 엔드 튜브(eend tube)에 넣습니다. 병아리를 흉부가 위로 향하도록 웨이 보트(whey boat)로 옮깁니다. 깨끗한 해부 도구 세트를 사용하여 복부와 흉골을 절개하고 복강을 열어 배아를 노출시킵니다.먼저, 우엽 또는 좌엽에서 간 조직 일부를 채취합니다. 이제 장기들을 연결하고 있는 내장을 절개하며 조심스럽게 장기를 꺼냅니다. 폐 하나를 선택하고 흉곽에서 분리하기 위해 폐의 네 면을 둘러가며 절개합니다.일관성을 위해 각 동물에서 동일한 폐를 채취하십시오. 장기를 즉시 처리하지 못하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.이종이식된 Hep 3 종양을 제거한 후 조직학적 분석을 수행하였습니다. 이는 Hep 3 종양의 tri RME 염색 결과입니다. 종양의 뚜렷한 엽들 사이로 종양의 기질 성분이 명확하게 나타납니다.여기 GFP를 발현하는 hep three 세포를 정맥 주사한 후 형광 현미경으로 관찰한 모습입니다. 정맥 주사 하루 후에는 산재된 개별 종양 세포만 보이지만, 주사 3일 후에는 세포 수가 증가하고 전이 세포의 작은 군집이 형성되고 있음이 분명하게 나타납니다. 이식 후 7일 동안의 전이 수준은 인간 A LU 서열에 대한 실시간 PCR을 사용하여 정량화되었습니다.오늘 저희가 시연한 기술은 매우 정량적인 고부가가치 모델입니다. 숙련된 실험자는 시간당 약 30마리의 동물을 준비할 수 있으며, 추가적으로 2주라는 기간 내에 조류 배아 모델의 발달 후 전이를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이 기술을 통해 암 생물학 분야의 연구자들은 천연 면역 결핍 모델을 사용하여 전이를 정량적으로 분석할 수 있게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 형질전환 제브라피시 배아의 주위 공간으로 유방암 세포를 전달하는 미세주입 방법을 설명합니다. 배양 후, 형광 현미경으로 배아를 시각화하여 암세포의 침입, 전파 및 전이를 관찰합니다.

zPDX-침습성 분석: 제브라피시 배아 이종이식편에서 전이성 암세포의 침습적 행동 조사

이 비디오에서는 암세포를 닭 융모막막에 이식하여  난자  모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 부인암의 진행을 연구하기 위해 난소암 세포를 성공적으로 생착시킵니다.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis(닭 융모막막기반 암 모델링: 암세포 종양 형성 및 전이를 연구하기 위한 In Ovo 모델)

이 동영상은 닭 융모막막혈관 구조에 암세포를 정맥 주사하여 CAM 암 전이 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 주입된 세포는 결국 흩어져 있는 단일 암 세포 군체를 형성하여 암 침습 및 전이에 대한 연구를 가능하게 합니다.

닭 융모대질막막혈관구조에 암세포를 정맥 주사: 암 침입 및 전이를 연구하기 위한 융모대립막암 모델을 확립하는 절차

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

우리는 부인과 및 비뇨기과 암 세포주 및 환자 유래 종양의 이식에 대한 대안, 이식 가능한 생체 내 모델로 닭 융모알구암 막 모델을 제시합니다.

비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

암세포의 전이성 능력을 평가하기 위한 CAM-Delam 분석은 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴하다. 이 방법은 전이 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 풀고 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 인간 종양 샘플을 분석하기 위한 최적화된 분석은 개인화된 암 치료를 위한 임상 방법이 될 수 있다.

CAM-Delam Assay, 암세포의 박리 및 침윤 능력을 정량화하여 전이성 특성을 점수화하기 위한 분석

학습하세요 조류 엠브리오 막(CAM) 모델을 이용한 암 전이 정량 분석 방법입니다. 인간 종양 세포의 전이 능력을 평가하고 정량 PCR로 데이터를 획득하는 기술을 익혀보세요.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

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