향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

다음 실험의 전반적인 목적은 에코트로픽(echo tropic) 렌티바이러스를 사용하여 인간 세포에 온코진(oncogenes) 또는 기타 잠재적 위험 유전자를 도입하는 것입니다. 이는 마우스 레트로바이러스 수용체를 인코딩하는 팬트로픽(pantropic) 렌티바이러스와 목적 유전자를 인코딩하는 에코트로픽 렌티바이러스를 제작함으로써 달성됩니다. 세포에 마우스 레트로바이러스 수용체를 형질도입하면 에코트로픽 바이러스의 형질도입에 민감해집니다. 다음으로, 형질도입 효율을 높이기 위해 폴리브레인(poly brain) 및 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)을 이용한 고분자 복합체 형성을 통해 온코진을 도입하도록 세포를 에코트로픽 바이러스로 형질도입합니다. 형광 현미경 및 FACS 분석을 통해 인간 세포가 에코트로픽 렌티바이러스에 의해 선택적으로 형질도입되었음을 보여주는 결과를 얻습니다.

감마 레트로바이러스 형질도입과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 렌티바이러스 입자가 줄기세포와 같이 분열하지 않는 세포를 포함한 많은 세포 유형을 더 효과적으로 형질도입할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 잠재적 발암유전자의 기능을 이해하는 것과 같이 암 및 줄기세포 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 기관의 안전 책임자에게 문의하고 권장되는 안전 지침을 따르십시오.

조직 배양 후드 내에서 건강하게 빠르게 성장하는 2 9 3 T 세포 배양물로 시작합니다. 무균 조건에서 5 × 10⁶ 개의 2 9 3 T 세포를 항생제가 없는 2 9 3 T 배지 10 mL에 재부유합니다. 세포 현탁액을 10 cm 조직 배양 플레이트에 분주하고, 37 °C 및 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 늦은 오후에 transfection을 시작합니다. 먼저 Optum과 transfer packaging 및 envelope plasmid의 일부를 취하여 실온에서 가온합니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 Optum 375 µL를 피펫으로 넣고, 이어서 FUgene HD transfection 시약 25 µL를 추가합니다. 이때 FUgene 시약이 튜브 벽면에 닿지 않고 배지 속으로 직접 투입되도록 주의하십시오.

다음으로, 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 transfer plasmid 5 µg, packaging plasmid 3.75 µg, 그리고 envelope plasmid 1.25 µg을 넣고, 전체 부피가 100 µL가 되도록 필요한 양의 Optum을 혼합합니다. 그 다음, 플라스미드 혼합물이 담긴 튜브에 Optum Fuji를 추가하고 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 종료 수분 전, 293T 세포가 포함된 플레이트에서 배지를 매우 조심스럽게 흡입하여 제거한 뒤, 항생제가 없는 신선한 293T 배지 10 mL로 교체합니다.

마지막으로, FU 유전자 플라스미드 혼합물을 10 centimeter 플레이트의 배지에 한 방울씩 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 배지를 매우 조심스럽게 흡입하여 제거하고 신선한 항생제 없는 2 9 3 T 배지로 교체합니다.

그런 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣고 2일 더 배양합니다. 형질전환 3일 후, 플레이트에서 바이러스가 포함된 배지를 흡입하여 0.45 micron 저단백 결합 필터로 여과합니다. 바이러스를 여과한 후, 6 µg/mL polybrene이 포함된 신선한 항생제 제거 배지에서 형광 대조군 바이러스를 단계별 희석하여 적절한 세포주 세포를 형질전환 하는 데 사용합니다. 다음 날 24웰 플레이트의 배지를 신선한 항생제 제거 배지로 교체하고, 세포가 형광 단백질을 발현할 수 있도록 2일 더 배양을 계속합니다.

각 바이러스 희석 배수별로 형광 세포 수를 사용하여 형질전환된 세포의 분율을 결정하십시오. 그 다음, 다중 형질전환 사건을 최소화하기 위해 형질전환 효율이 15% 미만인 희석 배수를 기준으로 밀리리터당 형질전환 단위(transforming units per milliliter)로 역가를 계산하십시오. 병행하여 제작된 다른 비형광 렌티바이러스의 역가는 형광 바이러스의 역가와 유사한 것으로 간주합니다.

표적 세포를 형질도입하려면, 대부분의 세포가 형질도입될 수 있도록 감염다중도(multiplicity of infection)를 2보다 크게 설정하는 것부터 시작하십시오. 먼저, 신선한 완전 배양 배지에서 바이러스 상청액을 필요한 감염다중도까지 희석합니다. 여기에 6 µg/mL의 polybrene을 첨가하여 최종 부피를 1 mL로 맞춥니다.

표적 세포가 담긴 35 mm 디시에서 배지를 흡입하여 제거하고, 희석된 바이러스 상층액 1 mL를 첨가합니다. SLC7A1 수용체가 충분히 발현되도록 원하는 경우 조직 배양 인큐베이터에서 24~48시간 동안 배양합니다. 서면 절차의 지침에 따라 blasticidin을 이용한 항생제 선택을 통해 SLC7A1을 발현하는 안정적으로 형질전환된 세포를 선택합니다.

독성 결정을 시작하려면, 20 mg/mL 농도의 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 표준 용액과 20 mg/mL 농도의 Poly brain 표준 용액을 증류수에 조제하고 멸균 여과합니다. 남은 표준 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

다음으로, 고분자 복합체의 독성을 정확하게 결정하는 데 필요한 96-웰 세포 배양 수를 결정합니다. MTT 분석을 사용하여, 콘드로이틴 황산염과 poly green의 최소 6가지 농도를 3회 반복 실험해야 합니다. 또한, 환원되지 않은 세포와 무혈청 배지에서 성장시킨 세포도 포함해야 합니다.

건강한 세포의 기준선을 제공하고 각각 성장 정지를 대조하기 위해 배지를 포함해야 합니다. 필요한 웰의 수가 확인되면, 96웰 플레이트의 각 웰에 표적 세포 5,000개를 분주하고, 이와 병행하여 각 실험 조건에서의 형질도입 효율에 대한 현미경 또는 팩트 기반 분석을 위해 24웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 두 세트의 세포를 모두 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 콘드로이틴 황산 스톡 용액의 일부와 폴리브레인 스톡 용액의 일부를 첨가합니다.

그 후, GFP를 인코딩하는 바이러스를 6 µg/mL의 poly brain이 포함된 항생제 없는 배지에서 희석하여, 웰당 타겟 세포의 약 10~50%를 형질전환시키기에 충분한 감염 다중도(multiplicity of infection)가 되도록 합니다. 각 플레이트의 컨트롤 웰과 모든 테스트 조건에 사용할 만큼 충분한 양의 희석된 바이러스를 준비하십시오. 테스트할 각 chondroitin sulfate 및 poly green 폴리머 농도별로 튜브 세트에 라벨을 부착합니다.

그런 다음, 각 조건에 대해 3회 반복 실험이 가능하도록 충분한 양의 바이러스 현탁액을 튜브에 분주합니다. 이어서, 테스트 농도를 맞추기 위해 필요한 부피의 콘드로이틴 황산염과 poly brain 스톡 용액을 각 튜브에 순서대로 피펫팅하여 넣습니다. 콘드로이틴 황산염과 poly green을 첨가한 직후, 튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다.

바이러스-콘드로이틴 황산-폴리그린 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 바이러스 침전물이 형성됨에 따라 혼합물이 탁해질 수 있습니다. 배양이 끝나면 96-웰 플레이트의 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 계획된 대로 바이러스 콘드로이틴 황산 폴리그린 혼합물을 웰에 추가합니다. 또한 대조군과 무혈청 배지를 적절한 웰에 피펫팅합니다. 24웰 플레이트에도 동일한 과정을 반복하고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 플레이트에서 바이러스가 포함된 배지를 흡입하여 제거하고 신선한 배지로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 24웰 플레이트를 꺼내고 FACS를 사용하여 각 chondroitin sulfate 및 poly brain 농도의 형질전환 효율을 분석합니다.

다음 날, 96-웰 플레이트의 모든 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 100 µL의 MTT 용액으로 교체한 후, 대사 활성 세포의 미토콘드리아 내에서 MTT가 환원될 수 있도록 습도가 유지되는 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, MTT 용액을 흡입하여 제거하고 200 µL의 용해 용액으로 교체합니다.

플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 보라색 MTT가 모두 형성되고 침전물이 용해될 때까지 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nanometers에서 흡광도를 측정하고, 690 nanometers에서의 배경값을 뺍니다. 최적의 폴리머 농도는 hdfs에 대한 MTT로 측정된 대사 활성에 미치는 영향은 최소화하면서, 전달 효율의 최대 향상을 유도하는 농도가 될 것입니다.

100 µg/mL의 chondroitin sulfate. 이 방법에 의해 결정된 최적의 폴리머 농도는 poly brain입니다. 먼저, SLC7A1 수용체를 발현하는 HDF 세포가 담긴 35 mm 디쉬의 필요한 개수를 형질도입시키기에 충분한 양의 100 µg/mL chondroitin sulfate poly green 바이러스 상층액 혼합물을 준비합니다. 폴리머 복합체가 형성될 수 있도록 혼합물을 5분 동안 배양합니다.

그 후, 표적 세포를 발현하는 수용체에서 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스 혼합물로 교체한 다음, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 혼합물을 제거한 후, 바이러스 복합물의 제거를 돕기 위해 세포 표면을 PBS로 두 번 세척합니다. 잔류 폴리머 복합물이 세포 건강에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으므로 완전히 제거할 필요는 없습니다.

이 형광 현미경 이미지는 형광 대조 벡터를 사용하여 형질전환 효율을 모니터링했을 때, tropic 바이러스에 의한 SLC7A1 안정 발현 인간 육종 세포의 충분한 형질전환을 보여줍니다. FACS 분석을 이용한 형광 정량 결과, 90% 이상의 형질전환 효율이 입증되었습니다. HDFS의 형질전환율은 일반적으로 더 낮은데, 이는 해당 세포들이 receptor 발현을 위해 blast aside 및 선택 과정을 거치지 않았기 때문입니다. atropic 렌티바이러스의 역가는 일반적으로 VSV pseudo typed 바이러스의 10~20% 수준이었으며, 이는 S-L-C-H-S-C에서 측정되었습니다. MTT 생존능 분석을 통해 여기에서 보는 바와 같이, 바이러스와 chondroitin sulfate 농도 처리 시 표적 세포의 성장 정지를 민감하게 검출할 수 있습니다.

밀리리터당 최대 800 µg의 Poly brain은 HDF 대사에 영향을 미치지 않습니다. 다양한 농도의 콘드로이틴 황산염과 함께 바이러스가 형질도입된 HDF의 Fax 분석 결과입니다. Poly green은 Poly green 단독 사용 시와 비교하여 형질도입이 향상되었음을 보여줍니다.

최대 증강은 100 µg/mL에서 나타납니다. Chondroitin sulfate poly brain은 이전에 보고된 값보다 수 배 더 낮았습니다. 따라서 주어진 세포 유형의 chondroitin sulfate 복합체 형성을 위한 조건을 최적화하는 것이 중요합니다.

Poly brain은 S-L-C-H-S-C에서 관찰된 타이터(titer)를 약 3배 향상시킵니다. 실제로 이는 높은 바이러스 농도에서보다 낮은 바이러스 농도에서 형질전환 효율에 더 큰 영향을 미치는데, 이는 높은 바이러스 농도에서 여러 세포가 형질전환되고 수용체 포화가 일어나기 때문일 가능성이 가장 큽니다. 친화성 바이러스(tropic virus)를 이용한 형질전환은 뉴런 레트로바이러스 수용체를 발현하는 세포에 특이적입니다.

수정되지 않은 인간 세포에 트로픽 바이러스(tropic virus)를 형질전환시켰을 때, FACS 분석 및 현미경 관찰 결과 환원되지 않은 배경값보다 높은 형광은 관찰되지 않았습니다. HDFS는 수용체가 없을 때 형질전환이 일어나지 않았으나, 수용체를 미리 형질전환시킨 후에는 형광 세포가 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 바이러스가 수정된 인간 세포에서는 형질전환을 일으키지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후, 폴리머 복합체 형성을 통해 형질도입 효율을 높이는 방법을 포함하여, 잠재적으로 위험한 유전자를 인간 세포에 전달하기 위해 트로픽 렌티바이러스를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.