Name: 향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 학습하세요 인간 세포에 온코진을 안전하게 도입하는 에코트로픽 렌트로바이러스 형질도입법을 폴리머 복합체를 활용해 형질도입 효율을 높이고 암 연구의 안전성을 확보하는 방법을 배우세요.

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이 프로젝트에 대한 자금은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 제공되었다.

1. 렌티바이러스 생산, 수확 및 동결
<ol>
	<li>본 프로토콜을 시작하기 전 소속 기관의 안전 관리 책임자와 상담하고, 권장되는 안전 가이드라인을 준수하십시오.</li>
	<li>1일 차. 바이러스를 생산하기 위해 건강하고 빠르게 성장하는 293T 세포로 시작하십시오. 세포를 5 x 106 
	10 cm 플레이트당 세포 수. 바이러스 생산에는 항생제가 없는 293T 배지(10% FBS와 4 mM L-glutamine이 포함된 고농도 포도당 DMEM)를 사용하십시오.</li>
	<li>2일 차. 늦은 오후에 다음과 같이 293T 세포를 형질전환합니다 (제시된 수치는 10cm 플레이트 1개 기준입니다).
모든 시약을 실온에서 예열하십시오. 파이펫으로 분주하여 375 μl 마이크로원심분리 튜브에 OptiMEM을 넣은 후, 다음을 추가합니다. 25 μl 
	Fugene HD. 희석되지 않은 Fugene이 튜브 표면에 닿지 않도록 하십시오.</li>
	<li>마이크로 원심분리 튜브에 다음을 넣고 혼합하십시오:
		<ul>
			<li>5 μg 전달 플라스미드 (Slc7a1, 표적 벡터 또는 형광 대조 벡터)</li>
			<li>3.75 μg 패키징 플라스미드 (pCMV-dR8.91 또는 psPax2)</li>
			<li>1.25 μg 외피 플라스미드(범용성-pantropic의 경우 pMD2.G, 세포친화성-ecotropic의 경우 pHCMV-EcoEnv)</li>
			<li>혈청 제거 OptiMEM으로 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>두 튜브를 합치고 혼합물을 실온에서 20~30분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>293T 세포의 배지를 10ml의 신선한 항생제 무첨가 293T 배지로 교체하십시오. Fugene/플라스미드 혼합물을 플레이트에 한 방울씩 첨가하고 다음 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 37°C, 5% CO22.</li>
	<li>3일 차. 293T 세포의 배지를 10ml의 신선한 항생제 미포함 293T 배지로 교체하십시오. 293T 세포는 부착력이 약하며, 배지를 단일층 위에 너무 강하게 피펫팅하면 세포가 떨어져 나갈 수 있으므로 조심스럽게 조작하십시오. 바이러스 생산을 위해 습도가 조절된 배양기에서 2일 동안 배양하십시오.</li>
	<li>5일 차. 바이러스를 수확하고 0.45 mm 저단백 결합 필터로 여과한다. 즉시 사용하거나 1회용 분주량으로 나누어 -에서 냉동 보관한다.80°C냉동 보관된 범친화성(pantropic) 및 외친화성(ecotropic) 바이러스는 각각 6개월 및 1개월 후에 역가를 재측정해야 합니다.</li>
	<li>형질전환 효율이 비교적 높은 세포를 사용하여 다음과 같이 바이러스 역가를 측정합니다. 신선한 배지가 포함된 상태에서 연속 희석(예: 1:10, 1:10, 1:10)을 통해 형광 대조 바이러스를 세포에 하룻밤 동안 형질전환합니다. 6 μg/ml PB. 다음 날 신선한 배지로 교체하십시오. 형광 단백질이 발현되기까지 형질 도입 후 2일 동안 세포를 배양한 다음, FACS를 통해 형질 도입된 세포의 비율을 결정하십시오. 다음의 희석 배수에서 얻은 결과에 기초하여 ml당 형질 전환 단위(TU)로 역가를 계산하십시오. &lt; 다중 형질전환 사건을 최소화하기 위해 15%의 형질전환율을 유지합니다. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="역가 계산 공식, 바이러스 정량 방정식, 바이러스학의 수학적 분석." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="식 1">
	</li>
</ol>
2. 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1을 이용한 인간 표적 세포의 형질도입
<ol>
	<li>대부분의 세포가 형질전환될 수 있도록 감염다중도(MOI)를 2로 선택하십시오. HDF와 같이 형질전환에 저항성이 있는 표적 세포의 경우 더 높은 MOI가 필요하며, 본 실험에서는 대다수 세포의 형질전환을 유도하기 위해 바이러스 상층액을 1:2로만 희석하였습니다.</li>
	<li>신선한 배양 배지에 희석된 바이러스 상층액을 사용하여 대상 세포를 하룻밤 동안 형질전환한다. 6 μg/ml PB는 바이러스와 표적 세포 사이의 정전기적 상호작용을 강화하여 형질도입 효율을 높입니다.1 형질 도입 효율에 있어 확산이 제한 요인이 되므로, 35 mm 플레이트의 경우 1 ml와 같이 최소량의 바이러스를 사용하는 것이 이상적입니다. </li>
	<li>Slc7a1 수용체가 충분히 발현되도록 하기 위해, 바이러스를 제거한 후 최소 48시간 동안 세포를 배양한 다음 ecotropic 바이러스를 형질도입하십시오.</li>
	<li>(선택 사항) 원하는 경우, blasticidin을 사용하여 Slc7a1을 발현하는 안정적 형질전환 세포를 선택할 수 있습니다. 일반적으로 2 – 사이인 최저 유효 농도를 결정하기 위해 사전에 blasticidin 사멸 곡선(kill curve)을 작성해야 합니다. 10 μg/ml이는 7일 이내에 형질전환되지 않은 모든 표적 세포를 사멸시킵니다. Slc7a1 바이러스를 제거하고 약 2일 후에, 형질전환된 세포를 blasticidin이 포함된 배지로 교체합니다. 세포를 blasticidin 포함 배지에서 7일 동안 배양하면, 남아 있는 모든 세포가 레트로바이러스 수용체를 안정적으로 발현하게 되며, 이때부터 ecotropic 바이러스로 형질전환하거나 향후 사용을 위한 안정적 Slc7a1 발현 세포주로 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 독성 결정을 위한 폴리머 복합체 적정
<ol>
	<li>1일 차. 96-well 플레이트에 웰당 50 cells/well의 밀도로 세포를 분주하며, 각 실험군당 최소 3개 이상의 반복 웰을 확보한다. 건강한 세포의 기준값을 제공하기 위해 완전 배지 내의 비형질전환 세포를 포함시키고, 대조군으로서 성장 정지를 유도하기 위해 무혈청 배지 내의 세포로 구성된 샘플을 포함한다. 이와 병행하여, 각 실험 조건에서 형질전환 효율을 현미경 또는 FACS 기반으로 분석하기 위해 적절한 형식(예: 24-well 플레이트)으로 세포를 분주한다.</li>
	<li>2일 차. MTT 및 FACS 분석을 위해 준비된 플레이트의 세포에 target 세포의 약 40%가 형질전환되도록 0.5의 MOI로 GFP를 인코딩하는 바이러스를 형질전환시킨다. 최적량을 결정하기 위해 다양한 농도의 CS/PB(예: 각 성분당 50, 10, 20, 40, 60, 800 mg/ml) 및 6 μg/ml PB를 테스트한다. 폴리머 복합체는 아래의 Part 4에 설명된 대로 생성한다.</li>
	<li>3일 차. 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 플레이트를 습윤 배양기에 넣는다.</li>
	<li>5일 차. FACS 플레이트를 분석하여 각 폴리머 농도에 따른 형질전환 효율을 결정한다. </li>
	<li>6일 차. MTT 플레이트의 모든 웰에서 배지를 제거하고 10 μl MTT 용액(완전 배지 내 1 mg/ml MTT)으로 교체한다. 대사 활성 세포의 미토콘드리아에서 MTT가 환원될 수 있도록 습윤 배양기에서 3시간 동안 배양한다.</li>
	<li>MTT 용액을 제거하고 20 ml MTT 용매(isopropanol 내 0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630)로 교체한다. </li>
	<li>실온에서 2시간 동안 또는 보라색 MTT formazan 침전물이 모두 용해될 때까지 배양한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 690 nm에서의 배경 값을 뺀다. </li>
	<li>FACS로 결정된 형질전환의 최대 향상을 유도하면서, MTT로 결정된 대사 활성에 미치는 영향이 최소화되는 최적의 폴리머 농도를 선택한다. HDFs의 경우, 아래의 대표 결과(Representative Results)에 제시된 데이터를 기반으로 10 μg/ml CS/PB를 선택하였다.</li>
</ol>
4. 폴리머 복합체 형성을 통한 에코트로픽 형질도입
<ol>
	<li>PB와 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)의 멸균 여과된 20 mg/ml 수성 스탁 용액을 준비합니다. 소분하여 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>바이러스 상청액을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 신선한 배양 배지로 희석하여 원하는 최종 농도(예: MOI 2)로 맞춥니다. PB와 콘드로이틴 황산염(위의 3단계에서 결정된 농도)을 동일한 부피로 순차적으로 첨가하고, 각 첨가 후 튜브를 톡 쳐서 혼합합니다. 침전물이 형성되면서 바이러스 혼합액이 즉시 탁해집니다. 복합체 형성을 위해 바이러스 혼합액을 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>수용체 발현 표적 세포에서 배지를 제거하고 바이러스 혼합액으로 교체한 후, 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 혼합액을 제거한 후, 바이러스 복합체 제거를 돕기 위해 세포 표면을 PBS로 2회 세척합니다. 완전히 제거할 필요는 없으며, 잔류 폴리머 복합체가 세포 건강에 미치는 부정적인 영향은 관찰되지 않았습니다.</li>
</ol>
5. ecotropic 형질도입의 특이성 검증
<ol>
	<li>에코트로픽(ecotropic) 바이러스를 처음 생산할 때, 안전 관점에서 바이러스가 변형되지 않은 인간 세포를 형질전환시킬 수 없는지 확인하는 것이 바람직합니다. 상대적으로 높은 농도의 에코트로픽 렌티바이러스(신선한 배지에 바이러스 상청액을 1~2배만 희석)와 6 μg/ml PB 또는 최적화된 CS/PB 농도를 사용하여 인간 세포를 하룻밤 동안 형질전환시킵니다.</li>
	<li>바이러스가 포함된 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체합니다. 세포를 2일 동안 배양한 후, 형광 벡터를 이용한 FACS 또는 트랜스진 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR을 통해 트랜스진 발현을 검증합니다.</li>
</ol>
6. 대표 결과:
그림 1A는 렌티바이러스 생성 과정을 보여주며, 그림 1B는 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1의 사전 형질전환을 포함하여 인간 세포에 에코트로픽(ecotropic) 렌티바이러스를 형질전환하는 과정을 보여줍니다. 바이러스 역가 측정을 위해, Slc7a1이 안정적으로 형질전환된 인간 횡문근육종 세포주(Slc-hRMS)를 사용합니다. 형질전환 효율을 모니터링하기 위해 형광 대조 벡터를 사용할 때, 일반적으로 다음과 같은 결과를 얻습니다. &gt; 그림 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, ecotropic virus를 이용한 Slc-hRMS의 형질도입 효율은 90%입니다. HDF의 형질도입률은 일반적으로 더 낮게 나타나는데, 이는 해당 세포들이 수용체 발현을 위해 blasticidin 선택 과정을 거치지 않았기 때문입니다(그림 2C). Slc-hRMS에서 측정했을 때, ecotropic lentivirus의 타이터(titer)는 일반적으로 VSV-pseudotyped virus의 10-20% 수준입니다(그림 2D).
한 번의 동결-해동 주기는 ecotropic virus의 역가를 16 - 3% 감소시키며, 이는 VSV-pseudotyped virus의 단일 동결-해동 주기 동안의 역가 손실과 동일합니다 (p &gt; 0.05). 이전 보고서들과 달리,2 드라이아이스를 이용한 급속 냉동이 바이러스 역가에 긍정적인 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다. 오히려 바이러스 튜브를 -80°C 냉동고에 단순히 보관함으로써 두 pseudotype 모두 더 높은 해동 후 역가를 얻었습니다 (데이터 미제시). 
MTT 생존능 분석을 통해 표적 세포의 성장 정지를 민감하게 검출할 수 있습니다. 바이러스와 최대 80 μg/ml 농도의 CS/PB를 함께 전달했을 때 HDF 대사에는 영향이 없었습니다(그림 3A). 바이러스 없이 CS/PB에만 노출시킨 경우에도 세포에 독성 효과는 나타나지 않았습니다(데이터 미제시). 바이러스와 다양한 농도의 CS/PB를 함께 전달한 HDF의 FACS 분석 결과, PB 단독 처리와 비교하여 전달 효율이 향상되었음을 확인하였습니다(그림 3B). 최대 향상 효과는 10 μg/ml CS/PB에서 나타났으며(그림 3C), 이는 이전에 보고된 수치보다 수 배 더 낮은 농도입니다.3 따라서 특정 표적 세포 유형에 맞게 조건을 최적화하는 것이 중요합니다.
CS/PB와의 복합체 형성은 Slc-hRMS에서 관찰된 역가를 약 3배 향상시킵니다 (그림 4A, p &lt; 0.01). 실제로, 이는 고농도의 바이러스보다 저농도의 바이러스에서 형질전환 효율에 더 큰 영향을 미치며 (그림 4B), 이는 고농도의 바이러스에서 다중 형질전환된 세포와 수용체 포화 현상이 발생하기 때문일 가능성이 가장 높습니다.
ecotropic 바이러스를 이용한 형질전환은 마우스 레트로바이러스 수용체를 발현하는 세포에 특이적입니다. 그림 5A에 나타난 바와 같이, 수정되지 않은 인간 세포에 ecotropic 바이러스를 형질전환할 때 PB 또는 CS/PB 사용 여부와 관계없이 형질전환되지 않은 배경값보다 큰 형광은 관찰되지 않았습니다. 현미경 관찰 결과, 수용체가 없는 경우 HDF에서는 형질전환이 나타나지 않았으나(그림 5B), 수용체를 사전 형질전환한 경우에는 형광 세포가 나타났습니다(그림 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="렌티바이러스 생성 공정 도식으로, 293T 세포의 형질도입 및 바이러스 상층액 단계를 나타냄." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. ~의 모식도 (A) 바이러스 생산 과정 및 (B) 마우스 레트로바이러스 수용체를 이용한 인간 세포의 형질전환 및 이어지는 에코트로픽 렌티바이러스 형질전환.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="유세포 분석 그래프, GFP+ 세포 비율 분석, 형광 현미경 검사, 바이러스 역가 막대 그래프." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. GFP를 인코딩하는 ecotropic 렌티바이러스를 이용한 인간 세포의 고효율 형질도입. 세포는 마우스 레트로바이러스 수용체인 Slc7a1로 사전 형질도입되었다. (A) Slc7a1에 대해 블라스티시딘(blasticidin) 선택 과정을 거친 인간 횡문근육종 세포주(Slc-hRMS), GFP로 형질도입됨(파란색) 또는 형질도입되지 않음(분홍색). (B) ecotropic-형질전환된 Slc-hRMS의 형광 현미경 사진 (4배율). (C) ecotropic GFP 렌티바이러스로 형질전환된(파란색) 및 형질전환되지 않은(분홍색) HDF; 세포들은 ecotropic 형질전환 2일 전에 Slc7a1로 형질전환되었다. (D) Slc-hRMS에서 측정된 VSV-G 슈도타입 및 ecotropic 렌티바이러스의 역가.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="GFP 발현에 미치는 폴리머 농도의 영향; 흡광도, 유세포 분석 및 GFP% 그래프." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 3"> 
그림 3. 인간 진피 섬유아세포에서 콘드로이틴 황산/폴리브렌(CS/PB) 농도 최적화. (A) PB만 단독으로 처리했거나 다양한 농도의 CS/PB를 함께 처리하여 형질전환시킨 후, MTT 분석으로 측정한 HDF의 생존율. (B) FACS로 측정한 서로 다른 농도의 CS/PB에 의한 HDF의 형질도입 효율 향상. (C) 형질전환 증강의 정량화; 최대 형질전환이 발생하는 지점을 보여줌 100 μg/ml 컴퓨터 과학/생물물리학.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="유전자 도입 효율 대 타이터 분석, 막대 그래프 및 산점도, 폴리브렌(polybrene) 효과 비교." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 4"> 
그림 4. ~의 효과 400 μg/ml ecotropic 렌티바이러스를 이용한 Slc-hRMS 형질전환에 관한 CS/PB. (A) 역가 향상 및 (B) ~ 대비 도입률의 배수 변화 6 μg/ml polybrene 단독 처리.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="GFP+ 세포 분포를 보여주는 형광 현미경 이미지와 유세포 분석 GFP 강도 그래프." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 5"> 
그림 5. 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1이 없을 때 인간 진피 섬유아세포(HDFs)의 에코트로픽 형질전환 결핍. (A) 수용체 Slc7a1이 없는 상태에서 ecotropic GFP 렌티바이러스를 처리하지 않은(분홍색) 또는 처리한(파란색) BJ 인간 섬유아세포의 FACS 플롯. ecotropic GFP 렌티바이러스를 처리한 BJ 인간 섬유아세포, - 없이 (B) 및 ~와 함께 (C) 수용체 Slc7a1(4X)을 이용한 사전 형질전환.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

몰로니 murine의 백혈병 바이러스 (MLV)과 그 수용체 mSlc7a1에 따라 재조합 ecotropic gammaretrovirus 잘 연구하고 널리 없습니다 murine 세포 transgenes를 제​​공하기 위해 20여 년 동안 사용되고 보내고있다. Ecotropic gammaretrovirus도 인간의 세포 oncogenes를 제공하기 위해 최근 사용되고 있습니다,. 셀룰러 프로그래밍의 맥락에서, mSlc7a1의 사용은 잘 설립 인간 oncogenes을 품고 amphotropic 바이러스의 생성을 피하기 위해 4,5 단, lentivirus은 gammaretrovirus에 비해 상당한 장점을 제공합니다 lentiviral 사전 통합 복잡한 허용하기 때문에 내화물 세포 집단, 종종 프로그래밍을 위해 바람직 목표물 6를 포함한 기본 세포를 transducing가 아닌 나누어 세포의 형질 도입 7. Lentiviruses는 바이러스 tropism, 독성, 및 기타 특성 8. MLV - pseudotyped ecotropic의 lentivirus은 마우스 세포, 9 transduce하는 데 사용되었지만 거의 인간의 세포에 사용되지 않은 내용을 변경하기 위해 MLV를 포함한 다양한 pseudotypes 수십, 함께 제작되었습니다 10. 우리는 따라서 인간의 세포에 세포 프로그래밍 요소를 포함하여 알려지거나 의심 oncogenes을, 제공하는 안전하고 비용 효율적인, 그리고 고효율 차량으로 MLV - pseudotyped ecotropic lentivirus의 사용을 제안합니다. 오히려,이 프로토콜은 암 관련 바이러스 자체 접종 잠재력에서 연구자를 단열, pantropic 바이러스에서 oncogene (들)을 분리, 그것은이 프로토콜은 완전히 pantropic lentivirus을 생산하고 사용할 필요성을 제거하지 않습니다에 중요합니다. 단백질 mSlc7a1과 인간 homologue의 hSlc7a1는 ubiquitously 알려진 tumorigenicity 또는받는 사람 세포에 선택 성장 우위를 부여하는 능력, amphotropic 바이러스에 설립에 대한 상대적으로 낮은 위험이 11 만들기 mSlc7a1 아니요 아미노산 운반을 표명하고 있습니다. 이것은 추가 단계 필요 biosafety 수준의 전용 바이러 스나 조직 문화 시설 부족 실험실에서 특히 유용할 수 있습니다. 어떤 상황에서는 완전히 대상 세포에 직접 Slc7a1이 플라스미드 transfecting에 의해 pantropic 바이러스의 사용을 제거하는 것이 가능 수 있지만,이 기술의 유용 대상 될 많은 세포는 transfection에 내화물 있습니다. 대안으로 분리할 수있는 능력 blasticidin 선택하여 세포를 Slc7a1는 - transduced 것은 VSV - G pseudotyped lentivirus가 ecotropic 바이러스가 많은 이들 세포를 transduce하기 위해 일상적으로 사용할 수있는 이후 수용체 - 표현 세포의 주식을 생성 한 번 사용될 수있다는 것을 의미 실험. 연구원에 관계없이 항상 그 tropism의 모든 lentivirus 작업을 위해 제도적 안전 지침을 따라야합니다. 이 프로토콜과 함께 실현 ecotropic 바이러스 Titers 이전 연구와 합의에 일반적으로 VSV - pseudotyped 바이러스, pantropic 바이러스 titer의 10~20%보다 적당히 낮은 9. 이러한 titers가 안정 Slc7a1와 transduced 인간의 세포로 측정되었다, 그래서 낮은 ecotropic 바이러스에 대한 관찰 titer는 대상 세포에있는 수용체 유전자의 다양한 표현에 일부가 원인일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리 프로토콜 획득 바이러스 titers은 대부분의 어플 리케이션을위한 충분한보다되며 어떤 경우에는 세포의 과반수의 도입으로 이어질&gt; 세포의 90 %. 원심 분리 기반 기술은 일반적으로 바이러스 입자를 집중하는 데 사용됩니다. 그러나, 원심 분리는 몇 시간을 필요로 전염성 에어로졸을 생성하고, 바이러스 입자의 상당한 손실이 발생할 수 있습니다. 12 대안, CS / PB와 함께 complexation으로이 바이러스 tropism를 변경하지 않고 전달을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 3이 방법은 (5 분 빠른있다 대략 관찰된 tit​​er를 tripling 동안 (10 ML 바이러스 당 $ 0.03)) 저렴. 특별한 장비 또는 독점적인 시약이 필요하지 않으며 다른 세포 라인의 이전 작업과 동의, CS / PB에 HDFs의 노출 후 최소한의 급성 독성을 관찰하고 있습니다.이 프로토콜 13 한 잠재적인 단점이 몇 가지 미세 표시 폴리머 단지가 고수이다 문화에 몇 일 동안 세포. 우리는이 단지는 세포에 독성 명백히 없지만, 세포 프로세스에 대한 자세한 미묘한 영향을 수있는 가능성을 배제할 수 없습니다. 여기 우리는 안전하고 효과적으로 종양 발생 요인과 인간의 세포를 transducing위한 방법론을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 IPS 세포를 포함한 oncogenes 및 줄기 세포 생물학을 공부하면서 연구에 큰 유틸리티의해야합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17,224 </td><td> Murine MLV 수용체 </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12,259 </td><td> VSV - G 봉투 </td></tr><tr><td> pCMV - dR8.91 </td><td> D. Trono 연구소 14 </td><td></td><td> 포장 플라스미드 (이에 상응하는 플라스미드 psPax2가 Addgene에서 구할 수 고양이. 넘버 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV - EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15,802 </td><td> Ecotropic 봉투 </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14,883 </td><td> 플라스미드 GFP 제어 </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> 로체 </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimethrine 브로마이드 (Polybrene) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> 상어 연골의 콘드로이틴 황산 나트륨 소금 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> 어부 </td><td> BP 2,647,100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium 브로마이드 (MTT) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA - 630 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

향상된 biosafety에 대한 고분자 - complexed ecotropic lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

줄기 세포 및 종양 생물학 연구는 종종 실험실 직원에 대한 주요 안전 문제를 제기, 알려진 또는 의심되는 oncogenes와 인간 세포의 바이러스 전달을 필요로합니다. 등 일반적으로 사용되는 VSV - G pseudotype로 Pantropic lentiviruses는, 그들이 아닌 나누어 세포를 포함하여 많은 세포 유형을 transduce 수 있기 때문에 유전자 기능을 연구를위한 유용한 도구입니다. 그러나, 연구자들은 높은 biosafety 수준의 처리 요구 사항 및 안전 문제로 인해 oncogenes을 인코딩 pantropic 바이러스의 생산과 원심 분리를 방지하실 수 있습니다. C - Myc 및 SV40 큰 T 항원을 포함한 여러 적정량 oncogenes은, 유도 pluripotent 줄기 세포 (iPSC)의 생산을 강화하는 것으로 알려져 있습니다. 다른 모든 알려진 iPSC - 유도 유전자 변화 (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, 그리고 함수의 p53의 손실)도뿐만 아니라 상대적으로 높은 안전 우려를 제작, 암로 연결되는 링크를 제공하고 있습니다. 이러한 암 관련 바이러스가 세포 프로그래밍 및 pluripotency 공부에 도움이되지만, 그들은 안전하게 사용해야합니다. 이러한 biosafety 문제를 해결하기 위해, 우리는 감소 비용과 편리한 처리에 대한 자세한 중심으로, ecotropic lentivirus와 인간 세포의 형질 도입에 대한 방법을 보여줍니다. 우리는보다 90 % 이상 transduce 충분히 높은 titer와 ecotropic lentivirus을 생산해야 수용체를 표현하는이 방법의 효능을 확인, 바이러스에 노출된 인간의 세포를. Lentivirus은 종종 ultracentrifugation에 의해 집중되어 있으나,이 과정은 몇 시간 걸립니다 인간의 생명 의학 연구에 전염성 에어로졸을 생성하실 수 있습니다. 대안, 바이러스 입자는보다 안전 콘드로이틴 황산 및 polybrene (CS / PB)와 complexation하여 세포에 sedimented 수 있듯이. 이 기술은 안정 무시할 추가 시간과 비용, murine 레트로 바이러스의 수용체를 표현 세포 3 배에 기능 바이러스 titer를 증가시킵니다. 인간 피부 섬유아 세포 (HDFs)의 도입은 maximally되는 고분자 농도가 관심의 대상 세포 유형에 대한 titrated되어야 제안, 이전에 암 세포 라인에 대한보고 최적의 가치보다 약 4 배 낮은 CS / PB 농도를 사용하여 향상된 것입니다. 따라서 새로운 셀 타입 고분자 독성에 대한 분석을 methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium 브로마이드 (MTT)의 사용을 설명합니다. 우리는 최소한의 급성 독성을 나타내는, 폴리머 complexation 또는 polybrene (PB, 6 μg / ML)의 표준 복용량을 사용하여 바이러스 전달 후 HDFs의 ​​동등한 가능성을 관찰합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 biosafety 위험을 줄이고 전달 속도를 증가, 인간의 세포에 oncogenes의 overexpression에 대한 ecotropic lentivirus의 사용을 설명합니다. 바이러스 입자 에어로졸 - 성형 원심 분리를 피하는 동안 우리는 또한 전달을 향상시키기 위해 고분자 complexation의 사용을 보여줍니다.

Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

줄기세포 및 종양 세포 생물학 연구에서는 알려져 있거나 의심되는 발암 유전자를 인간 세포에 바이러스로 도입하는 형질도입 과정이 필요한 경우가 많으며, 이는 ...에 대한 중대한 안전 문제를 야기합니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 에코트로픽(echo tropic) 렌티바이러스를 사용하여 인간 세포에 온코진(oncogenes) 또는 기타 잠재적 위험 유전자를 도입하는 것입니다. 이는 마우스 레트로바이러스 수용체를 인코딩하는 팬트로픽(pantropic) 렌티바이러스와 목적 유전자를 인코딩하는 에코트로픽 렌티바이러스를 제작함으로써 달성됩니다. 세포에 마우스 레트로바이러스 수용체를 형질도입하면 에코트로픽 바이러스의 형질도입에 민감해집니다. 다음으로, 형질도입 효율을 높이기 위해 폴리브레인(poly brain) 및 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)을 이용한 고분자 복합체 형성을 통해 온코진을 도입하도록 세포를 에코트로픽 바이러스로 형질도입합니다. 형광 현미경 및 FACS 분석을 통해 인간 세포가 에코트로픽 렌티바이러스에 의해 선택적으로 형질도입되었음을 보여주는 결과를 얻습니다.감마 레트로바이러스 형질도입과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 렌티바이러스 입자가 줄기세포와 같이 분열하지 않는 세포를 포함한 많은 세포 유형을 더 효과적으로 형질도입할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 잠재적 발암유전자의 기능을 이해하는 것과 같이 암 및 줄기세포 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 기관의 안전 책임자에게 문의하고 권장되는 안전 지침을 따르십시오.조직 배양 후드 내에서 건강하게 빠르게 성장하는 2 9 3 T 세포 배양물로 시작합니다. 무균 조건에서 5 × 10⁶ 개의 2 9 3 T 세포를 항생제가 없는 2 9 3 T 배지 10 mL에 재부유합니다. 세포 현탁액을 10 cm 조직 배양 플레이트에 분주하고, 37 °C 및 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 늦은 오후에 transfection을 시작합니다. 먼저 Optum과 transfer packaging 및 envelope plasmid의 일부를 취하여 실온에서 가온합니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 Optum 375 µL를 피펫으로 넣고, 이어서 FUgene HD transfection 시약 25 µL를 추가합니다. 이때 FUgene 시약이 튜브 벽면에 닿지 않고 배지 속으로 직접 투입되도록 주의하십시오.다음으로, 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 transfer plasmid 5 µg, packaging plasmid 3.75 µg, 그리고 envelope plasmid 1.25 µg을 넣고, 전체 부피가 100 µL가 되도록 필요한 양의 Optum을 혼합합니다. 그 다음, 플라스미드 혼합물이 담긴 튜브에 Optum Fuji를 추가하고 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 종료 수분 전, 293T 세포가 포함된 플레이트에서 배지를 매우 조심스럽게 흡입하여 제거한 뒤, 항생제가 없는 신선한 293T 배지 10 mL로 교체합니다.마지막으로, FU 유전자 플라스미드 혼합물을 10 centimeter 플레이트의 배지에 한 방울씩 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 배지를 매우 조심스럽게 흡입하여 제거하고 신선한 항생제 없는 2 9 3 T 배지로 교체합니다.그런 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣고 2일 더 배양합니다. 형질전환 3일 후, 플레이트에서 바이러스가 포함된 배지를 흡입하여 0.45 micron 저단백 결합 필터로 여과합니다. 바이러스를 여과한 후, 6 µg/mL polybrene이 포함된 신선한 항생제 제거 배지에서 형광 대조군 바이러스를 단계별 희석하여 적절한 세포주 세포를 형질전환 하는 데 사용합니다. 다음 날 24웰 플레이트의 배지를 신선한 항생제 제거 배지로 교체하고, 세포가 형광 단백질을 발현할 수 있도록 2일 더 배양을 계속합니다.각 바이러스 희석 배수별로 형광 세포 수를 사용하여 형질전환된 세포의 분율을 결정하십시오. 그 다음, 다중 형질전환 사건을 최소화하기 위해 형질전환 효율이 15% 미만인 희석 배수를 기준으로 밀리리터당 형질전환 단위(transforming units per milliliter)로 역가를 계산하십시오. 병행하여 제작된 다른 비형광 렌티바이러스의 역가는 형광 바이러스의 역가와 유사한 것으로 간주합니다.표적 세포를 형질도입하려면, 대부분의 세포가 형질도입될 수 있도록 감염다중도(multiplicity of infection)를 2보다 크게 설정하는 것부터 시작하십시오. 먼저, 신선한 완전 배양 배지에서 바이러스 상청액을 필요한 감염다중도까지 희석합니다. 여기에 6 µg/mL의 polybrene을 첨가하여 최종 부피를 1 mL로 맞춥니다.표적 세포가 담긴 35 mm 디시에서 배지를 흡입하여 제거하고, 희석된 바이러스 상층액 1 mL를 첨가합니다. SLC7A1 수용체가 충분히 발현되도록 원하는 경우 조직 배양 인큐베이터에서 24~48시간 동안 배양합니다. 서면 절차의 지침에 따라 blasticidin을 이용한 항생제 선택을 통해 SLC7A1을 발현하는 안정적으로 형질전환된 세포를 선택합니다.독성 결정을 시작하려면, 20 mg/mL 농도의 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 표준 용액과 20 mg/mL 농도의 Poly brain 표준 용액을 증류수에 조제하고 멸균 여과합니다. 남은 표준 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.다음으로, 고분자 복합체의 독성을 정확하게 결정하는 데 필요한 96-웰 세포 배양 수를 결정합니다. MTT 분석을 사용하여, 콘드로이틴 황산염과 poly green의 최소 6가지 농도를 3회 반복 실험해야 합니다. 또한, 환원되지 않은 세포와 무혈청 배지에서 성장시킨 세포도 포함해야 합니다.건강한 세포의 기준선을 제공하고 각각 성장 정지를 대조하기 위해 배지를 포함해야 합니다. 필요한 웰의 수가 확인되면, 96웰 플레이트의 각 웰에 표적 세포 5,000개를 분주하고, 이와 병행하여 각 실험 조건에서의 형질도입 효율에 대한 현미경 또는 팩트 기반 분석을 위해 24웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 두 세트의 세포를 모두 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 콘드로이틴 황산 스톡 용액의 일부와 폴리브레인 스톡 용액의 일부를 첨가합니다.그 후, GFP를 인코딩하는 바이러스를 6 µg/mL의 poly brain이 포함된 항생제 없는 배지에서 희석하여, 웰당 타겟 세포의 약 10~50%를 형질전환시키기에 충분한 감염 다중도(multiplicity of infection)가 되도록 합니다. 각 플레이트의 컨트롤 웰과 모든 테스트 조건에 사용할 만큼 충분한 양의 희석된 바이러스를 준비하십시오. 테스트할 각 chondroitin sulfate 및 poly green 폴리머 농도별로 튜브 세트에 라벨을 부착합니다.그런 다음, 각 조건에 대해 3회 반복 실험이 가능하도록 충분한 양의 바이러스 현탁액을 튜브에 분주합니다. 이어서, 테스트 농도를 맞추기 위해 필요한 부피의 콘드로이틴 황산염과 poly brain 스톡 용액을 각 튜브에 순서대로 피펫팅하여 넣습니다. 콘드로이틴 황산염과 poly green을 첨가한 직후, 튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다.바이러스-콘드로이틴 황산-폴리그린 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 바이러스 침전물이 형성됨에 따라 혼합물이 탁해질 수 있습니다. 배양이 끝나면 96-웰 플레이트의 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다.그런 다음 계획된 대로 바이러스 콘드로이틴 황산 폴리그린 혼합물을 웰에 추가합니다. 또한 대조군과 무혈청 배지를 적절한 웰에 피펫팅합니다. 24웰 플레이트에도 동일한 과정을 반복하고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 플레이트에서 바이러스가 포함된 배지를 흡입하여 제거하고 신선한 배지로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 24웰 플레이트를 꺼내고 FACS를 사용하여 각 chondroitin sulfate 및 poly brain 농도의 형질전환 효율을 분석합니다.다음 날, 96-웰 플레이트의 모든 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 100 µL의 MTT 용액으로 교체한 후, 대사 활성 세포의 미토콘드리아 내에서 MTT가 환원될 수 있도록 습도가 유지되는 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, MTT 용액을 흡입하여 제거하고 200 µL의 용해 용액으로 교체합니다.플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 보라색 MTT가 모두 형성되고 침전물이 용해될 때까지 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nanometers에서 흡광도를 측정하고, 690 nanometers에서의 배경값을 뺍니다. 최적의 폴리머 농도는 hdfs에 대한 MTT로 측정된 대사 활성에 미치는 영향은 최소화하면서, 전달 효율의 최대 향상을 유도하는 농도가 될 것입니다.100 µg/mL의 chondroitin sulfate. 이 방법에 의해 결정된 최적의 폴리머 농도는 poly brain입니다. 먼저, SLC7A1 수용체를 발현하는 HDF 세포가 담긴 35 mm 디쉬의 필요한 개수를 형질도입시키기에 충분한 양의 100 µg/mL chondroitin sulfate poly green 바이러스 상층액 혼합물을 준비합니다. 폴리머 복합체가 형성될 수 있도록 혼합물을 5분 동안 배양합니다.그 후, 표적 세포를 발현하는 수용체에서 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스 혼합물로 교체한 다음, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 혼합물을 제거한 후, 바이러스 복합물의 제거를 돕기 위해 세포 표면을 PBS로 두 번 세척합니다. 잔류 폴리머 복합물이 세포 건강에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으므로 완전히 제거할 필요는 없습니다.이 형광 현미경 이미지는 형광 대조 벡터를 사용하여 형질전환 효율을 모니터링했을 때, tropic 바이러스에 의한 SLC7A1 안정 발현 인간 육종 세포의 충분한 형질전환을 보여줍니다. FACS 분석을 이용한 형광 정량 결과, 90% 이상의 형질전환 효율이 입증되었습니다. HDFS의 형질전환율은 일반적으로 더 낮은데, 이는 해당 세포들이 receptor 발현을 위해 blast aside 및 선택 과정을 거치지 않았기 때문입니다. atropic 렌티바이러스의 역가는 일반적으로 VSV pseudo typed 바이러스의 10~20% 수준이었으며, 이는 S-L-C-H-S-C에서 측정되었습니다. MTT 생존능 분석을 통해 여기에서 보는 바와 같이, 바이러스와 chondroitin sulfate 농도 처리 시 표적 세포의 성장 정지를 민감하게 검출할 수 있습니다.밀리리터당 최대 800 µg의 Poly brain은 HDF 대사에 영향을 미치지 않습니다. 다양한 농도의 콘드로이틴 황산염과 함께 바이러스가 형질도입된 HDF의 Fax 분석 결과입니다. Poly green은 Poly green 단독 사용 시와 비교하여 형질도입이 향상되었음을 보여줍니다.최대 증강은 100 µg/mL에서 나타납니다. Chondroitin sulfate poly brain은 이전에 보고된 값보다 수 배 더 낮았습니다. 따라서 주어진 세포 유형의 chondroitin sulfate 복합체 형성을 위한 조건을 최적화하는 것이 중요합니다.Poly brain은 S-L-C-H-S-C에서 관찰된 타이터(titer)를 약 3배 향상시킵니다. 실제로 이는 높은 바이러스 농도에서보다 낮은 바이러스 농도에서 형질전환 효율에 더 큰 영향을 미치는데, 이는 높은 바이러스 농도에서 여러 세포가 형질전환되고 수용체 포화가 일어나기 때문일 가능성이 가장 큽니다. 친화성 바이러스(tropic virus)를 이용한 형질전환은 뉴런 레트로바이러스 수용체를 발현하는 세포에 특이적입니다.수정되지 않은 인간 세포에 트로픽 바이러스(tropic virus)를 형질전환시켰을 때, FACS 분석 및 현미경 관찰 결과 환원되지 않은 배경값보다 높은 형광은 관찰되지 않았습니다. HDFS는 수용체가 없을 때 형질전환이 일어나지 않았으나, 수용체를 미리 형질전환시킨 후에는 형광 세포가 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 바이러스가 수정된 인간 세포에서는 형질전환을 일으키지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 폴리머 복합체 형성을 통해 형질도입 효율을 높이는 방법을 포함하여, 잠재적으로 위험한 유전자를 인간 세포에 전달하기 위해 트로픽 렌티바이러스를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을...

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여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

일차 인간 기관지 상피 세포는 형질도입이 어렵습니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스의 생산과 농도뿐만 아니라 가성층화된 상피로의 분화를 통해 이러한 세포에서 매우 효율적인 형질도입을 달성하는 데 필요한 최적의 배양 조건을 설명합니다.

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

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효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

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여기서는 고정된 포유류 세포에서 폴리(ADP-리보스)(PAR) 농축 초점의 세포 기반 시각화, 아세포 위치 및 정량적 분석을 기술합니다. 이 분석법은 제노톡신 노출 세포 핵에서 염기 절제 수리 또는 단일 가닥 절단 복구와 관련된 DNA 손상 유도 PARP 활성화 부위를 정량화할 수 있게 합니다.

형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

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향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

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