마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

이 실험 절차의 전반적인 목표는 야생형 및 돌연변이 생쥐의 유선 발달을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 생쥐를 해부하여 유선을 노출시킴으로써 수행됩니다. 그다음, 유선을 적절히 채취하여 유리 슬라이드 위에 펼칩니다, calm lum.

그 후, 염색을 통해 상피 발달 정도를 분석합니다. 마지막으로, oxytocin 노출에 따른 근상피세포의 수축을 분석합니다. 최종적으로, 얻어진 결과는 유선관과 폐포가 적절하게 형성되었는지, 그리고 oxytocin 노출 시 근상피세포가 수축하여 유즙을 배출하도록 유도될 수 있는지를 밝혀줄 것입니다. 이 방법은 유선 형태 및 기능에 미치는 유전자 돌연변이 또는 knockout의 영향과 같이, 유선 발달 및 분화와 관련된 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 유선의 적절한 박리를 보장하며, 이는 홀 마운팅(hole mounting)과 옥시토신 기반 분석 모두 잘 준비된 유선을 필요로 하기 때문입니다. 유선 박리가 제대로 이루어지지 않으면 일부 상피관이 누락되거나 피부 또는 근육 조직과 같은 이물질이 포함될 수 있습니다. 박리 최소 하루 전에 CalMin alum 용액을 준비하십시오. CalMin 1g과 황산알루미늄칼륨 2.5g을 증류수 500mL에 녹여 CalMin alum 용액을 제조합니다.

1L 플라스크에서 용액을 20분 동안 끓인 후, 물을 더해 최종 부피를 500mL로 맞춥니다. Watman 여과지로 용액을 여과하고 보존제로 thiol을 몇 알갱이 첨가합니다. 그 후 염색이 끝나면 용액을 냉장 보관합니다.

탄산명반 용액은 원래의 보관 병에 다시 부어 몇 주 동안 여러 번 재사용할 수 있습니다. 용액의 색이 옅어지면 새로운 용액을 제조하십시오. 기억샘 해부를 시작하려면, 이산화탄소 흡입법을 사용하여 마우스를 희생시킵니다.

경추 탈구는 목의 주요 혈관을 손상시켜 유선 주변에 혈액이 고이게 할 수 있으므로 가능한 한 피하십시오. 이는 호일로 감싼 폴리스티렌 폼 위에서 해부를 더 어렵게 만드는 요인이 됩니다. 마우스를 등 쪽이 바닥에 닿게 놓은 다음 네 다리를 펼치십시오.

16~20 gauge 바늘을 사용하여 네 다리를 모두 단단히 고정합니다. 핀셋을 사용하여 마우스에 70% ethanol을 충분히 뿌립니다. 복부 중앙선의 피부를 들어 올리고, 절개 부위부터 날카로운 가위로 작게 절개합니다.

복강이나 흉강을 찌르지 않도록 주의하며 동물의 목까지 피부를 절개합니다. 앞다리의 피부를 중앙 절개선까지 절개하여 Y자 모양이 되게 합니다. 뒷다리의 피부도 동일한 방식으로 절개합니다.

지혈鉗子(hemostatic forceps)를 사용하여, 필요한 경우 마우스의 복부와 흉부 피부를 옆으로 조심스럽게 벗겨냅니다. 결합 조직을 조심스럽게 절개합니다.

16~20 gauge 바늘을 사용하여 피부를 폴리스티렌 폼에 고정하고, 피부 아래쪽에 부착된 유선을 노출시킵니다. 핀셋을 사용하여 유선을 하나씩 분리합니다. 분석 대상인 유선을 조심스럽게 들어 올린 다음, 작은 정밀 가위로 바깥쪽에서 동물의 척추 방향으로 유선과 피부 사이를 절개합니다.

선 조직에 피부나 근육 조각이 남지 않도록 주의해서 절단하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 모든 유선을 제거할 수 있으나, 전체 마운팅(whole mounting)에는 4번 복부 유선이 가장 적합합니다. 마우스에서 유선을 적출한 후, 유리 슬라이드 위에 바로 펼쳐 놓으십시오.

가능한 한 최대한 평평하게 펴십시오. 원래의 in situ 형태를 유지하면 샘이 슬라이드에 잘 부착됩니다. 흄 후드 내에서 적절히 펼친 후, 슬라이드를 카노 고정액(Carnoy's fixative)이 담긴 병에 담가 샘을 고정하십시오.

실온에서 4시간 동안 고정액에 처리합니다. 또는 4°C에서 하룻밤 동안 선 조직을 고정합니다. 다음으로, 70% ethanol로 조직을 15분 동안 세척합니다.

그다음 단지에서 에탄올 용액의 절반을 제거하고 이를 2중 증류수로 교체하여 점진적으로 재수화합니다. 5분 동안 배양합니다. 이 과정을 3회 반복하고, 2중 증류수로 5분 동안 헹굽니다.

그 다음 날, 상온에서 하룻밤 동안 카본 알룸(carbon alum)으로 샘을 염색합니다. 재사용을 위해 카본 알룸 염색액을 제거하고, 단계별 에탄올 배스에 각각 5분씩 담가 염색된 조직을 점진적으로 탈수합니다. 그런 다음 자일렌(xylene)에서 하룻밤 동안 투명화 처리를 합니다. 투명화 작업 후, 유선을 메틸 살리실레이트(methyl salicylate)에 침지시키며, 이미지를 촬영할 준비가 될 때까지 메틸 살리실레이트는 흄 후드 내에 보관합니다. 유선 발달은 관의 일부 구간을 따라 분지 또는 측가지의 수를 세어 정량화할 수 있으며, 주관의 길이 또는 상피 조직 대비 지방 조직 면적의 비율을 평가할 수 있습니다.

유선 발달 및 기능을 평가하는 데 사용되는 두 번째 분석법은 유선에 oxytocin을 처리하여 상피관으로의 유즙 분출을 평가하는 것입니다. 이 분석을 수행하려면, 갓 수유한 새끼들을 어미로부터 떼어내고 어미를 한 시간 동안 격리해야 합니다. 다음으로, 어미를 희생시킨 후 유선 박리법에 설명된 대로 유선을 노출시킵니다.

하지만, 그것들을 동물 체내에 그대로 둡니다. 전이 피펫을 사용하여 PBS 또는 옥시토신 용액 3~5 mL를 대상 유선 위에 고르게 떨어뜨려 분석을 시작합니다. 이 절차에서는 흉선 유선을 사용하며, 한쪽은 대조군으로, 다른 한쪽은 유즙 분비 테스트용으로 사용할 것을 권장합니다.

샘을 1분 동안 배양한 후, 트랜스퍼 피펫으로 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. PBS 또는 옥시토신 노출 전후에 영상을 촬영하거나 비디오로 녹화하여 도관으로의 우유 유입을 모니터링합니다. 다음은 마우스 메모리의 예시입니다. 잘 펼쳐진 유선 전체 조직에서는 화살표로 표시된 상피 도관과 화살표 머리로 표시된 림프절을 쉽게 관찰할 수 있습니다.

유선 조직이 제대로 펴지지 않은 경우 슬라이드에서 떨어지거나 뭉칠 수 있으며, 이 경우 사용할 수 없게 됩니다. 유선을 부적절하게 적출하면 일부 조직이 누락되거나 근육 또는 피부 조각이 남아 있을 수 있습니다. 옥시토신에 노출된 후 상피 오리에서 옥시토신으로 유도된 유즙 분출을 관찰할 수 있습니다.

그러나 새끼의 마지막 포유 후 잠복기가 부적절하게 길어 분석 시작 시점에 이미 유관에 우유가 가득 차 있는 경우에는, 옥시토신 노출 후 유관 내에서 추가적인 우유 축적을 관찰하기 어렵습니다. 반대로, 새끼 포유 후 잠복기가 너무 짧으면 유선 절제 후 옥시토신 노출 시 유관에서 적절하게 관찰될 만큼 충분한 양의 우유가 폐포에 축적되지 않습니다. 유관의 장착이나 옥시토신 유도 유즙 분비 평가 대신, 유선을 급속 동결하여 저온 절편으로 만든 후 유선 내의 여러 상주 단백질에 대해 면역 표지법을 시행할 수 있습니다.

또는 대안적으로, 샘을 가용화하여 웨스턴 블로팅을 위한 준비를 할 수 있습니다. 이 두 가지 평가 방법을 통해 주요 유전자가 결손되도록 제작되었거나 유전자에 변이가 있는 다양한 마우스 모델에서 샘의 발달, 분화 및 기능과 관련된 근본적인 질문들을 다룰 수 있었습니다.