Name: 야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 학습하세요 야생 조류에서 조류 독감 바이러스를 현장에서 신속히 진단하는 휴대용 RRT-PCR 방법을. 동결 건조 시약을 활용하여 24시간 내 결과를 얻고 유행병 대응 능력을 향상시킵니다.

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우리는 기술 지원과 자금 조달 (S. Schwarzbach 호텔) 및 지원 (K. Spragens, T. 그레이엄)의 USGS 서부 생태 연구 센터 M. 비천한 사람과 아이다호 기술의 R. 크리 스프 감사하고 싶습니다. 국방부와 공군 연구소의학과 지원 국방 및 국토 안보부 (www.idhs.org) 연구소 - 본 연구는 혁신적인 기술을위한 센터의 후원하에 수행되었다. 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 간행물의 무역, 제품 또는 회사 이름의 사용은 설명용으로만 사용되며, 미국 정부에 의해 승인을 의미하지는 않습니다.

1. 미스트 그물을 사용하여 야생 조류 캡처 <ol><li> 쇼어 버드 캡처 들어, 마시, ​​해안, 또는 머드 플랫과 같은 적극적인 식량 약탈을 배워 현장에서 미스트 그물을 설정합니다. </li><li> 슬라이드 트레멀 라인 극 주변 미스트 그물의 한쪽 끝을의 루프와 진흙으로 수직 막대기를 삽입합니다. </li><li> NET을 당겨 미스트 네트의 다른 끝에 트레멀 루프를 통해 초 장대를 삽입하고 수직으로 트레멀 라인이 진행되었는지 만들기, 진흙에 장대를 삽입합니다. </li><li> 새가가 캡처되면 네트워크에서 새를 추출하고 banding 역으로 돌아갑니다. </li></ol> 2. Cloacal 면봉 샘플링 <ol><li> 즉시 캡처 후 cloacal 면봉를 수집 </li><li> 배설강을 찾아 주변 깃털을 다시 밀어 손가락을 사용하여 </li><li> 멸균 Dacron 또는 폴리에스터 - 스쳐 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 살균 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다. moistening 후, 면봉의 전체 머리를 부드럽게 하수구에 삽입됩니다. 천천히 면봉을 휘두르네 및 하수구에서 면봉을 제거하여 하수의 면봉은 내부 원주. </li><li> 직접 바이러스 수송 미디어 샘플 약병에 면봉의 팁을 삽입, 면봉은 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 샤프트를 회전. 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 방해하지 않도록 조교는 가위로 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 당기는하여 절차를 완료하고 면봉의 샤프트를 차단 캡 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독. </li><li> 드라이 아이스이나 얼음 팩을 중 하나를 포함하는 냉동실 상자에 튜브를 삽입합니다. </li></ol> 3. Oropharyngeal 면봉 샘플링 <ol start="1"><li> choanal 짧게 볼 수 있도록 부드럽게 새의 부리를 열고 </li><li> 패키지에서 깨끗한 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다 </li><li> 다른 표면에 끝을 건드리지 않고, 입 및 면봉으로 입안의 지붕에있는 choanal 오프닝에 삽입하고 oropharyngeal 또는 인후 지방쪽으로 계속 </li><li> 직접 바이러스성 전송 미디어 약병에 면봉의 끝을 놓으십시오. 면봉이 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 축을 회전. 위와 같이, 지원자가 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 뽑아 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 뚜껑에 방해가되지 않도록 가위로 면봉의 샤프트를 차단 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독. </li><li> 드라이 아이스 또는 얼음 팩이 들어있는 냉장고 상자에 튜브를 삽입합니다. </li></ol> 4. 버드 처리 및 릴리스 <ol start="1"><li> 적시 (&lt;20mins)에서 캡처 및 릴리스의 사이트에 새를 반환합니다. 처리기는 동물 복지의 원칙을 인식하고 샘플링하는 동안 고통 조류의 징후 (예 : 찰과상, myopathy 및 하이포 또는 고열을 캡처)에 대한 경고해야합니다. 기본적인 구급 상자가 장비 목록에 포함되어야합니다. </li></ol> 5. 시험 시설 <ol start="1"><li> 샘플은 PCR 장치와 연결된 컴퓨터를 실행하는 전원 공급 장치 (전압 - 규제 발전기)와 같은 연구 트레일러 또는 십t 같은 밀폐된 공간에서 테스트할 수 있습니다. </li></ol> 6. RNA 추출 <ol start="1"><li> RNA 추출은 스팩맨 외 다음과 같은 제조 업체의 지침을 약간 수정 RNeasy 미니 키트와 함께 수행했다. 1 </li><li> 소용돌이 면봉의 3-5 s에 대한 중간 및 2 ML의 microcentrifuge 관 350 μl를 전송. 참고 : PCR 양성 샘플 rescreened 또는 H5 테스트를 실행해야 할 필요 경우에 얼음에 남은 샘플 보관하십시오. </li><li> 350 RLT 버퍼의 μl (β - 나와 함께) 5 S.위한 소용돌이 추가 </li><li> RNA 학년 70 % 에탄올 350 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 5,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 2 ML 수집 관에 위치 스핀 컬럼에 뜨는 600 μl를 추가합니다. 테스트 튜브 랙의 나머지 샘플을 보유합니다. </li><li> 흐름 -을 통해 10,000 XG 및 폐기 20 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 모든 샘플은 스핀 열의 통과 때까지 반복 17-18 단계를 반복합니다. </li><li> 깨끗한 2 ML 수집 튜브의 스핀 열의를 놓습니다. </li><li> 스핀 컬럼에 RW1 버퍼 700 μl를 추가하고 10,000 X G. 25 s를 원심 분리기 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 10,000 X G. 25 S에 대한 스핀 컬럼 및 원심 분리기 500 μl RPE 버퍼를 추가합니다 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> RPE 버퍼 두 세척 총 22 단계를 반복합니다. </li><li> 14,000 X G.시 추가 2 분 스핀 컬럼을 원심 분리기 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 스핀 컬럼을 장소와 nuclease없는 물 50μl를 추가합니다. 60 S. 위해 상온에서 알을 품다 </li><li> 10,000 xgf 60 s에 대한 회전에 의해 Elute RNA또는 60 S. 이곳은 얼음에 샘플을 정화. </li></ol> 7. 부정적인 컨트롤을 준비 <ol start="1"><li> 동결 건조된 시약은 TaqMan 프로브의 인플루엔자 대상 1 (ASAY - ASY - 0109)에 대한 아이다호 기술 프리즈 건조 시약 감지 키트의 지침에 따라 PCR 분석에 사용하기 위해 준비되었습니다. </li><li> 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 부정적인 제어 시약의 약병 (적색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 31-32를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 8. 준비 테스트 샘플 <ol start="1"><li> 알약은 하단에되도록 3 초에 대한 미지의 시약의 약병 (파란색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 정화 RNA 40 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 38-39를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 9. 긍정적인 컨트롤을 준비 <ol start="1"><li> 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 긍정적인 제어 시약의 약병 (녹색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 45-46를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 10. 모세관 튜브를 Centrifuging <ol start="1"><li> 일단 배치를위한 모세관 튜브의 모든 모세관 어댑터가 장착되어 미니 원심 분리기로 그들을 로드할 준비가되었습니다. </li><li> 1 S. 위해 아래 펄스 버튼을 누른 가장 낮은 설정에서 원심 분리기 이것은 테스트를 위해 준비에있는 바닥에 액체 전달합니다. </li></ol> 11. 빠른 작동 <ol start="1"><li> 새 파일을 만듭니다. 분류 긍정적인 제어, 부정적인 제어 및 샘플 (자신의 ID 번호에 의해). </li><li> 프로그램 1 : RNA 샘플 준비 잡아 <ol><li> 사이클 = 1 </li><li> 분석 모드 = 없음 </li><li> 대상 온도 = 40 </li><li> 부화 시간 = 30 분 </li><li> 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값) </li><li> 보조 온도 대상 = 0 (기본값) </li><li> 스텝 크기 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연 = 0 (기본값) </li><li> 수집 모드 = 없음 (기본값) </li></ol></li><li> 프로그램 2 : RNA 변성 <ol><li> 사이클 = 1 </li><li> 분석 모드 = 없음 </li><li> 대상 온도 = 94 </li><li> 부화 시간 = 120s </li><li> 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값) </li><li> 보조 온도 대상 = 0 (기본값) </li><li> 스텝 크기 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연 = 0 (기본값) </li><li> 수집 모드 = 없음 (기본값) </li></ol></li><li> 프로그램 3 : RNA의 증폭 <ol><li> 사이클 = 45 </li><li> 분석 모드 = 자동 분석 </li><li> 목표 온도, 세그먼트 1 = 94; 세그먼트 2 = 60 </li><li> 배양 시간, 세그먼트 1 = 0의, 세그먼트 2 = 20 S </li><li> 1 &amp; 2 독방 감금 온도 전환 속도 = 20 ° C / S (기본값) </li><li> 보조 온도 대상, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 단계 크기, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 취득 모드 = 없음 세그먼트 1; 세그먼트 2 = 싱글 </li></ol></li><li> 형광 매개 변수 <ol><li> 형광 채널 2 (Ch2 / 1) 모드를 표시합니다 이득 : <ol><li> 채널 1 (F1) = 1 </li><li> 채널 2 (F2) = 8 </li><li> 채널 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> 각 샘플에 대한 실시간 형광 데이터를 표시하려면, 관심의 샘플을 선택하고 화면의 하단에있는 '보기 그래프'버튼을 클릭 </li></ol></li><li> 각 모세관 경우, 결과는 다음과 같습니다 : <ul><li> # - 회전 목마의 회전 목마 위치를 식별 </li><li> 샘플 이름 - 샘플의 이름을 제공합니다 </li><li> 제어 - 각 샘플에 대한 샘플 유형을 indentifies </li><li> 점수 - 샘플에서 샘플의 형광 배경 형광의 수준 사이의 관계를 사용하여 계산 </li><li> 결과 - 샘플에 대한 전체 결과를 표시합니다 </li></ul></li></ol> 12. 대표 결과 : 현재 : 시험 / 미지의 시료에 대한 빨간색 '현재'통화 대상 해당 샘플에서 확인 및 제어가 성공했음을 나타냅니다. 감지되지 않음 : 테스트 / 알려지지 않은 샘플에 대한 녹색 '발견되지 않음'통화 대상 해당 샘플에서 발견하고 테스트 컨트롤이 성공 않았음을 나타냅니다. 반복하십시오 : '하시기 바랍니다 반복'는 긍정적이거나 부정적인 제어가 실패했음을 나타냅니다. 빠른 7,200에 의해 성공적인 분석의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 긍정적인 컨트롤은 증폭과 약 25 사이클 (X 축)에 감지 형광 (Y 축)을 생성합니다. 사이클 임계값 (CT)&gt; 35 동의 컷 - 오프 가장 AIV 참조 실험실입니다. 따라서,이 방법에 대한 긍정적인 컨트롤 AIV 감지주기의 접수 번호 (0-35) 이내에 형광 신호를 생산. 반면, 부정적인 제어도 45 사이클 후 형광 신호를 생성하지 않습니다. 마찬가지로, 서쪽 샌드 파이 퍼스에서 수집한 열두 샘플 새들이 AIV에 대한 부정적인 것을 나타내는 형광 신호를 생성하지 않았다. 전통적인 실험실에있는 모든 긍정적인 샘플의 후속 테스트는 거짓 반응이 잘못 생성되지 않도록하는 것이 좋습니다입니다. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="그림 1"> 미스트 그물을 사용하여 그림 1. 쇼어 버드 캡처. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 이상 샌드 파이 퍼스에서 cloacal와 oropharyngeal 샘플의 수집. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3. RNA의 증폭에 대한 신속한 7200을 프로그래밍. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. 신속한 7200 휴대용 RRT - PCR은 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 성공적인 분석에 나타납니다 어떻게 표시에 의해 생성된 Fluorogram가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">전체 크기 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li>
<li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds%3A+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 빠른 진단 방법은 AIV의 감시에 대한 야생 조류 샘플 시간 효과적이고 정확하게 테스트를 용이하게합니다. 휴대용 RRT - PCR의 훨씬 덜 엄격한 표본 스토리지 요구 사항은 액체 질소 화주 또는 드라이 아이스를 사용할 수없는 경우 감기 체인의 유지 보수가 허무 수 있습니다 원격 상황에 적합합니다. 또한, 우리는 실험실 기반의 분자 분석의 최소한의 지식과 현장 생물학 자에 의해 수행되어야 정도로 간단했다 동결 건조 시약과 그 샘플 분석을 발견했습니다. 기술은 비용 효율적인 시간 효율 또한했습니다. 한 연산자, 그것은 현장 환경에서 매일 AIV에 대해 42 검사의 결과, 세 배치를 실행하는 가능했다. 우리는이 시스템을 실행하는 데 필요한 모든 자료가있는 위치와 방법은 하루의 과정을 통해 운영자에게 배운 수에 회부 수 있다고 평가. 원격 현장 상황에 제한 요인은 휴대용 RRT - PCR 장치와 연결된 컴퓨터를 실행하는 데 필요한 전원 공급 장치는하지만, 이것은 전압 - 규제 휴대용 전기 발전기의 사용을 통해 완화 수 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> RNeasy 미니 스핀 칼럼 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 컬렉션 튜브 (1.5 &amp; 2 ML) </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> RNase없는 물 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 14.3 M β - 메르 캅 토 에탄올 솔루션 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> 와동 지니 2, 120V </td><td> 과학 산업 </td><td> SI - 0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman 인플루엔자 대상 1 (가수 분해 프로브) </td><td> 아이다호 기술 </td><td> ASAY - ASY - 0109 </td><td></td></tr><tr><td> Lightcycler 20ml 모세관 튜브 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ML 튜브에 대한 회전과 함께 마이크로 원심 분리기 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 (빠른) 7,200 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Windows XP Professional과 펜티엄 기반의 노트북 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Lightcycler 데이터 분석 소프트웨어 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr></tbody></table>

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 rrt - pcr 및 정지 - 건조 시약의 사용

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

야생 조류는 철새 flyways 따라 감시를하라는, H5N1 subtype의 고도 병원성 조류 독감 (HPAI)의 확산에 연루되었습니다. 조류 독감 바이러스에 대한 야생 조류 (AIV)의 샘플링은 종종 원격 지역에서 실시하지만, 결과는 종종 있기 때문에 분자 테스트 갖춘 실험실에 샘플을 수송하기 위해 필요 지연됩니다. 실시간 역방향 transcriptase 효소의 연쇄 반응 (RRT - PCR)은 AIV의 진단을위한 가장 정확하고 민감한 방법 중 하나를 제공하는 분자 기법입니다. RRT - PCR에 필요한 이전에 엄격한 실험실 프로토콜 이제 필드에 적응하고 있습니다. 서부 유럽 표준시 시약의 수준에서 감도로, 감기에 사슬을 요구하지 않습니다 (동결 건조된) 동결 건조 시약의 개발은 현장에게 실질적인 목표에 원격 테스트를 가져왔습니다. 여기 우리는 동결 건조된 시약을 고용 RRT - PCR 장치 (Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 또는 신속한, 아이다호 기술, 솔트 레이크 시티, UT) (인플루엔자 대상 1 Taqman를 사용하여 야생 조류의 AIV의 신속한 진단을위한 방법을 제시, ASAY을 - ASY - 0109, 아이다호 기술). 시약은 단일 튜브 적절한 농도에서 테스트에 필요한 모든 구성 요소를 포함 : primers, 프로브, 효소, 버퍼 내부 긍정적인 컨트롤, 부적 절한 보관 또는 서부 유럽 표준시 시약의 처리와 관련된 오류를 제거합니다. 휴대용 단위는 매트릭스 유전자 후 2-3 시간 후에 산출 결과를 대상으로 인플루엔자에 대한 화면을 수행합니다. 유전자 subtyping은 H5와 H7 프라이머와 함께도 가능합니다되는 대상에게 적혈구응집소 유전자를 설정합니다. 시스템은 철새 쇼어 버드 종의 자리에 시연 등 야생 조류에서 수집 cloacal와 oropharyngeal 샘플에 사용, 북부 캘리포니아에서 캡처한 서부 샌드피퍼 (Calidrus mauri). 적합합니다 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 기술의 주요 장점은 원격 위치에 확산을 포함하는의 기회를 증가, 야생 조류의 진단을 신속하게하는 것입니다. 현장 진단은 또한 야생 인구에 감염된 개인을 식별하고 공부에 대한 유용합니다. 호스트 생물학 (감염 면역 및 생리 반응)과 공간적 생태 (감염된 조류의 철새 실적)에 대한 정보를 수집하는 기회는 야생 조류가 장거리 AIV에 대한 벡터 역할을 수있는 범위에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.

이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

야생 조류는 H5N1 아형의 고병원성 조류인플루엔자(HPAI) 확산의 원인으로 지목되어 왔으며, 이에 따라 철새 이동 경로를 따라 감시 활동이...

이 절차의 전반적인 목적은 실험실 시설에서 떨어진 원격 야외 환경인 포획 현장에서 야생 조류의 조류 인플루엔자 바이러스(IV) 감염 여부를 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 미스트 넷팅(mist netting) 기법을 사용하여 야생 조류를 포획한 후, 즉시 총배설강 및 구강인두 시료를 채취함으로써 수행됩니다. 밀폐된 공간으로 이동한 후, RNZ Minikit을 사용하여 바이러스 운송 배지에서 RNA를 추출합니다. 그 다음 동결 건조 시약을 사용하여 양성 및 음성 대조군과 테스트 시료의 준비를 수행하고, 시료를 마이크로 모세관 튜브로 옮깁니다.절차의 마지막 단계는 Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device 또는 Rapid라고 불리는 휴대용 실시간 PCR 기기를 사용하여 양성 시료에서 바이러스 RNA를 증폭하는 것입니다. 결과적으로, 현장에서 시료를 수집한 후 24시간 이내에 야생 조류 내 IV의 존재 여부를 확인하는 결과를 얻을 수 있습니다. 진단 실험실에서 수행되는 기존 기술보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 포획 현장에서 조류 인플루엔자 바이러스의 양성 또는 음성 시료를 직접 확인할 수 있다는 점입니다.이 방법은 질병 발생의 억제와 다른 조류 집단으로의 전파 방지에 도움이 되며, 감염된 조류가 얼마나 멀리 비행할 수 있는지와 같은 생태학적 질문에 답하는 데에도 유용합니다. 이번 절차의 시연은 미국 지질조사국(US Geological Survey)의 생물학자인 Annie Schultz가 진행합니다. 도요-물떼새류 포획을 위해서는 습지 해안선, 갯벌 또는 염전과 같이 활발하게 먹이 활동이 이루어지는 장소를 선택하십시오.미세망(mist net)을 설치하려면, 미세망 한쪽 끝에 있는 트램멜 라인 루프를 찾아 각 루프를 폴에 끼웁니다. 그런 다음 폴의 끝부분을 진흙 속에 수직으로 삽입합니다. 첫 번째 폴이 설치되면, 먹이 활동 구역 위로 미세망을 펼쳐 고정합니다.미스트 네트 반대편 끝에 있는 트램멜 루프를 두 번째 폴에 수직으로 끼웁니다. 트램멜 라인이 팽팽해지도록 폴을 진흙에 삽입하십시오. 미스트 네트가 너무 팽팽하여 새가 부딪혔을 때 튕겨 나가지 않으면서도, 새가 그물에 걸렸을 때 그물이 과도하게 처지지 않을 정도의 적절한 긴장도를 유지하고 있는지 확인하십시오.새를 포획하면 그물에서 꺼내어 밴딩 스테이션으로 이동합니다. 동물의 스트레스를 최소화하기 위해 가능한 한 빠르게

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오는 실시간 역전사 PCR을 사용하여 바이러스 감염을 감지하는 정량적 방법을 보여줍니다. 역전사 단계는 RNA를 cDNA로 변환한 다음 PCR 주기를 통해 증폭합니다. 샘플에 바이러스 RNA가 존재한다는 것은 PCR에서 얻은 DNA의 증폭 및 해리 곡선을 분석하여 확인합니다.

바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

수정 가능한 닭고기 달걀은 높은 수율의 바이러스를 증명하는 편리하고 비용 효율적인 시스템을 제공하기 때문에 많은 양의 인간 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 데 널리 사용됩니다.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

저자는 인플루엔자 A 바이러스를 탐지하고 격리하기 위해 돼지 비강 물티슈를 수집하는 프로토콜을 제시합니다.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

신속 하 게 구축, 오프-그리드 실험실 설계 되었고 원격, 리소스 제한 전역 설정에 대 한 내장. 기능 및 물류 개선, 확장, 다기능 실험실 모듈의 중요 한 측면을 탐구 된다. 기본적인 실험실 작업에 대 한 점검 및 호흡기 바이러스 진단 테스트에 대 한 프로토콜 개발 이며 제시.

원격 실험실 관리: 호흡기 바이러스 진단

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

학습하세요 야생 조류에서 조류 독감 바이러스를 현장에서 신속히 진단하는 휴대용 RRT-PCR 방법을. 동결 건조 시약을 활용하여 24시간 내 결과를 얻고 유행병 대응 능력을 향상시킵니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

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