주변 혈액에 세균 Microflora의 시퀀싱 : HIV에 감염된 환자 경험

말초 혈액으로 전이되는 세균성 미생물군집의 시퀀싱입니다. HIV 감염 환자를 대상으로 한 저희의 연구 경험을 바탕으로, 저는 밀라노 대학교 감염병 및 열대 의학 클리닉의 조교수인 주니어 마티입니다. 이제 HIV 감염 환자의 말초 혈액에서 세균 DNA를 검출하고 시퀀싱하는 실험 방법을 보여드리겠습니다.

건강한 위장관에는 체액성 및 세포성 점막 면역 체계의 발달에 영향을 미치는 매우 다양한 상주 미생물이 군집을 이루고 있습니다. 미생물군은 강력한 점막 장벽을 통해 면역 체계로부터 보호되지만, 감염, 항생제 치료, 수술 후 합병증뿐만 아니라 암, 췌장염, 영양실조 환자와 같은 여러 임상 상태에 따라 위장관의 변화가 일어납니다.

HIV 감염은 위장관 장벽의 붕괴를 유발하며, 이는 점막 면역의 점진적인 기능 부전과 리포폴리사카라이드 및 박테리아 DNA 단편과 같은 박테리아 생물학적 생성물의 전신 순환계 유출로 이어집니다. 이러한 현상은 전신 면역 활성화의 원인이 되며, 본 영상에서는 박테리아 DNA의 검출 및 시퀀싱의 실험 단계를 시연합니다. HIV 감염 환자의 말초 혈액 내 존재 여부를 확인하기 위해 밀라노 대학교 감염병 및 열대 의학 클리닉 소속의 감염병 전임의 Camilla ti, 박사 과정 학생 Esther me, 박사 후 연구원 ju MariaI가 참여합니다. 본 실험의 목적은 HIV 감염 환자의 말초 혈액 샘플에서 박테리아 종을 식별하는 것입니다.

건강한 개인은 정상적인 장내 항상성을 나타내므로, HIV 감염자와 건강한 피험자 모두의 전혈을 사용할 것입니다. 건강한 피험자들에게서는 전이되는 미생물군집이 관찰되지 않을 것으로 예상합니다. 환자로부터 전혈을 채집한 후 혈장을 분리하겠습니다.

그 다음, PCIC 16 s 리보솜 유전자에 대한 광범위 PCR 반응을 수행하기 위해 DNA를 추출합니다. PCR 산물 생성 후, 정제, 클로닝 및 서열 분석을 수행합니다. 본 실험의 첫 번째 단계는 정맥 천자를 통한 혈액 채취이며, 이어서 혈장 분리를 진행합니다.

EDTA가 포함된 튜브에 약 9 mL의 전혈을 채취합니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 2000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 실온에서 원심분리를 수행하여 혈장을 분리합니다.

이제 혈장 샘플에서 DNA를 추출하겠습니다. 멸균 상태를 보장하기 위해 후드, 피펫 및 실험에 필요한 재료를 적절히 소독하며, 모든 재료를 UV 램프 아래에 최소 30분 동안 둡니다. UV 램프를 끄고, 소독제로 장갑을 닦은 후, 종이 타월 몇 장을 에탄올에 적셔 팁을 버릴 때마다 후드 아래에 배치합니다. DNA 추출 과정 동안 피펫을 젖은 종이 타월로 닦아줍니다.

이제 DNA 추출을 준비합니다. DNA는 제조사의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 추출합니다. 간단히 설명하면, 350 µL의 혈장을 2 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.

초순수를 음성 대조군으로 사용합니다. 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 리소좀 10 µL를 시료에 첨가합니다. 그 후 시료를 30분 동안 배양합니다.

원심분리 후, 지침에 따라 37°C에서 용액 A, 클로로포름 및 용액 B를 시료에 첨가합니다. 그러면 세 개의 뚜렷한 층이 나타납니다. 상층액을 수집하여 에탄올에 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.

다음 단계는 PRIC 16 s 리보솜 유전자를 증폭하기 위한 광범위 PCR 반응으로, 전용 실험실에서 수행됩니다. 다음과 같은 시약들을 사용하여 PCR 믹스를 제조합니다. 박테리아 Taq polymerase에 의한 잠재적 오염을 방지하기 위해, PCR 믹스를 4 °C에서 500 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 PCR 믹스를 분주합니다. 증폭이 필요한 샘플 수에 맞추어 분주하십시오. 이때 음성 및 양성 반응 대조군을 위한 분주량도 반드시 고려하시기 바랍니다.

써모사이클링(THERMOCYCLING)은 다음과 같은 조건으로 설정합니다. 94 °C에서 5분, 이어서 94 °C, 55 °C, 72 °C에서 각각 1분씩 40회 반복하고, 마지막으로 72 °C에서 10분간 수행합니다. 평균 소요 시간은 3시간입니다.

PCR 생성물은 2% AGROS 겔에서 시각화합니다. 이것은 PCR 생성물을 보여주는 2% agros 겔입니다. 첫 번째 레인에는 100 base pair 래더가 포함되어 있습니다.

두 번째 레인은 PCR 양성 대조군입니다. 세 번째 레인은 PCR 음성 대조군을 포함하고 있습니다. 네 번째 레인은 HIV 양성 환자의 샘플을 보여주며, 다섯 번째 레인은 증류수 레인을 포함합니다.

6번 레인은 건강한 개인의 샘플과 음성 PCR 반응을 보여줍니다. 7번 레인에는 물이 포함되어 있습니다. 다음 단계는 PCR 확인 과정입니다.

제조사의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제합니다. 이 단계에서는 필터가 포함된 여러 개의 컬럼이 사용됩니다. PCR 결과는 작업 시트에 기록합니다.

이제 블루-화이트 스크리닝(blue-white screen)을 이용한 클로닝을 진행하겠습니다. 이는 벡터로의 DNA 라이게이션 성공 여부를 검출할 수 있게 해주는 분자생물학적 기법입니다. 벡터는 컴피턴트 셀(competent cells)인 박테리아로 형질전환됩니다.

수용성 세포를 X-gal이 포함된 배지에서 배양합니다. 형질전환에 성공하면 박테리아 콜로니는 흰색으로 나타납니다. 성공하지 못한 경우 콜로니는 파란색으로 나타납니다.

X-gal은 세포가 베타-갈락토시다아제(beta galacto aase) 효소를 발현하는지 여부를 나타내고 대장균(e coli) 콜로니의 형질전환을 시각화하는 데 사용되며, IPTG는 베타-갈락토시다아제(beta galacto. Aase)의 발현을 유도합니다. X-gal과 IPTG를 암피실린이 포함된 플레이트에 도포하여 섞어줍니다. 제조사의 지침에 따라 PCR 산물, SALT 및 클로닝 벡터가 포함된 클로닝 혼합물을 준비합니다.

E coli 세포를 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 클로닝 믹스를 세포에 첨가하고, 열 충격 처리 후 평판에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 평판 위에 흰색과 파란색 콜로니가 형성됩니다.

흰색 콜로니는 PCR 산물이 삽입된 양성 결과이며, 푸른색 콜로니는 PCR 산물이 삽입되지 않은 음성 결과입니다. 10개의 흰색 콜로니와 1개의 푸른색 콜로니를 선택합니다.

각 콜로니를 2 mL의 액체 LB 배지에 넣습니다. ampicillin이 첨가된 배지에서 콜로니를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 하룻밤 동안 성장한 콜로니를 상용 mini prep 키트를 사용하여 플라스미드 추출에 사용합니다.

필터가 포함된 미니 컬럼이 이 단계에 사용됩니다. 플라스미드 추출 후, 플라스미드를 0.7%AROS 겔 상에서 시각화합니다. 이것은 미니 프렙(mini prep) 생성물을 보여주는 0.7%AROS 겔입니다. 첫 번째 레인에는 1kb 래더(ladder)가 포함되어 있습니다.

두 번째 레인에는 파란색 대조군 콜로니가 포함되어 있습니다. 세 번째부터 12번째 레인까지는 흰색 콜로니가 포함되어 있습니다. 결과는 작업 시트에 기록하며, 이어지는 시퀀싱 단계에서 플라스미드를 증폭합니다.

이러한 시약들을 사용하여 혼합물을 제조합니다. PCR 혼합물을 증폭이 필요한 시료 수에 맞춰 분주합니다. 열순환 조건은 96 °C에서 1분, 96 °C에서 10초, 50 °C에서 5초, 60 °C에서 4분으로 설정합니다.

25회 사이클 동안 진행합니다. 평균 소요 시간은 약 1시간입니다. 증폭 후, 필터가 포함된 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.

정제된 생성물을 플레이트에 로딩한 후, 이를 시퀀서에 넣습니다. 시퀀싱 서열이 확보되면 blast를 실행하여 각 콜로니의 박테리아 종을 식별합니다. 98%에서 100%의 서열 상동성을 보이는 콜로니를 양성으로 간주합니다.

이는 HIV 양성 환자 한 명의 혈장 내 박테리아 시퀀싱 예시입니다. 연구 결과, HIV 질환의 미생물 전위(microbial translocation)에는 다종 미생물총이 관여한다는 것이 밝혀졌습니다. 이로써 우리는 HIV 감염 환자의 전신 순환계에 높은 다종 미생물 미크로플로라(microflora)가 존재함을 확인하였습니다.

HIV 음성인 건강한 대조군 개체들의 말초혈액 내 세균 DNA는 검출 한계 미만이었으며, 이는 위장관의 무결성을 반영하는 것일 수 있습니다. 현재 저희 연구는 말초혈액 내 미생물군이 HIV 면역병인세 및 잠재적인 치료 반응 조절에 미치는 가능한 역할을 이해하고 조사하는 데 집중하고 있습니다.