Name: 주변 혈액에 세균 Microflora의 시퀀싱 : HIV에 감염된 환자 경험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 배우세요 HIV 감염 환자의 주변 혈액에서 세균 DNA를 검출하고 시퀀싱하는 방법을. 이 기술은 미생물 이동과 면역 반응의 관계를 이해하는 데 도움을 줍니다.

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HIV에 감염된 혈액 샘플 처리가 중요한 권고 사항이 필요합니다. 혈액의 모든 표본은 강력한 누출 방지 용기에 이송해야합니다. 컨테이너의 외관 및 표본 함께 모든 서류의 오염을 방지하기 위해 표본을 수집시주의해야합니다. 감염된 혈액을 처리하는 모든 사람은 장갑을 착용해야합니다. 장갑이 변경 및 손을 표본 처리 완료 후 세탁해야합니다. HIV에 감염된 혈액 샘플의 처리는 클래스 II 생물 학적 캐비닛 후드에서 수행되어야합니다. 기계 pipetting 보조를 사용해야합니다. 바늘이나 다른 샵스 (유리 예 : pipettes 또는 모세관 튜브 포함)의 사용은 아무런 대안이 없다는있는 경우로 제한되어야합니다. 실험실 표면은 혈액의 유출 후 적절한 화학 살균제로 소독해야하며 작업 활동을 완료하는 경우. 사용 오염된 물질은 재사용 전에 소독해야하거나 임상 폐기물 경로를 통해 정확하게 폐기해야합니다. 중재가 효과가 즉시 시작되어야합니다와 같은 잠재적으로 전염성이 혈액이나 체액 (즉, 이러한 요구하는 보편적인 예방 조치)에 직업 노출의 모든 사건은 응급으로 치료해야합니다. 프로토콜은 완성 오일이 필요합니다. 기간은 그림 1에 자세히 있습니다. 박테리아 종은 그림 2에서 설명한 방법을 사용 구분됩니다. 1. 샘플 컬렉션 <ol><li> 전체 혈액 9 ML은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 포함 튜브로 그린 것입니다. </li><li> 튜브는 플라즈마를 얻을 RT 10 분 2000 RPM에서 centrifuged 있습니다. </li><li> 플라즈마 멸균이 ML - Eppendorf 튜브에 수집됩니다. </li></ol> 2. 플라즈마 샘플에서 DNA 추출 <ol><li> 적절히 후드, pipettes 및 불임을 보장하기 위해 실험에 필요한 자료를 소독. </li><li> 최소한 30 분 동안 자외선 불빛 아래에서 모든 자료를 놓습니다. </li><li> 살균제로 소독 장갑을 닦으십시오. </li><li> 에탄올 몇 종이 타올을 만끽하고 후드 아래에 그들을 놓으십시오. 때마다 팁을는 젖은 종이 타월에 피펫을 닦아 삭제됩니다. </li></ol> DNA는 제조 업체의 지침 (예 : Easy - DNA 키트, Invitrogen, 칼스 배드 CA, 미국) 다음과 같은 상용 키트를 사용하여 추출됩니다. <ol start="5"><li> 플라즈마 350 μL은 살균 2ml eppendorf 튜브에 배치됩니다. </li><li> 필터링 ultrapure 물 350 μL는 대조군으로 사용됩니다. </li><li> 샘플로 라이 소 자임 (1mg/ml) 10 μL를 추가합니다. </li><li> 37 30 분 품어 ° C. </li><li> 용해 용액 500 μL를 추가하고 샘플을 부드럽게 섞는다. </li><li> 65 7 분 동안 품어 ° C. </li><li> 샘플에 클로로포름 900 μL를 추가합니다. </li><li> 샘플이 균일하게 점성 때까지 적극적으로 소용돌이. </li><li> 강수량 솔루션과 적극적으로 와동 200 μL를 추가합니다. </li><li> 단계를 분리하고 인터페이스를 형성 RT에서 10 분 동안 10,500 rpm으로 샘플을 원심 분리기. </li><li> 에탄올 100 % 1 ML를 포함하는 새로운 microcentrifuge 관에 상단 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 4 10 분 10,500 RPM에서 샘플을 원심 분리기 ° C. </li><li> 에탄올을 제거합니다. </li><li> 에탄올 70 % 1ml를 추가합니다. </li><li> 4 10 분 최대 속도로 샘플을 원심 분리기 ° C. </li><li> 에탄올을 제거합니다. 잔여 에탄올은 pipettator로 제거하여야한다. </li><li> ultrapure 물 50 μL의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 분광 광도계로 DNA 농도를 읽으십시오. </li></ol> 3. 16 rRNA 유전자 PCR PCR 증폭은 앞에서 설명한 9로 수행됩니다. <ol><li> 10X PCR 버퍼, 25 MM MgCl2 5 μL, 2 MM 총 dNTPs 5 μL, 50 μm의 프라이머 RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT) 1 μL, 50 μm의 프라이머 DG74 1 μL의 10 μL로 구성된 100 μL 반응 혼합물에서 DNA를 증폭 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), H20 34 μL와 DNA 형성 촉매 효소 (AmpliTaq 골드, 응용 Biosystem, 포스터 시티, CA, 미국) 0.5 μL. </li><li> 박테리아 DNA 형성 촉매 효소에 의해 오염 가능성을 방지하기 위해 필터의 PCR 믹스를 전송합니다. </li><li> 4 500 RCF에서 30 분 원심 분리기 필터 (Microcon, Millipore, 빌레 리카, MA, 미국) ° C. </li><li> (긍정적이고 부정적인 PCR 컨트롤, 샘플 및 추출 물) 증폭해야 샘플의 개수에 따라 나누어지는 PCR 믹스. </li><li> 다음과 같은 온도 조건에 자전거 타는 사람 사용 : 94 ° 10 분 C, 94시 일분 때마다 40 번 ° C, 55 ° C 72 ° C, 72 ° C. 10 분 </li><li> 2 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 시각화. 100 BP의 DNA의 사다리를 사용하십시오. PCR 제품 크기는 360 BP (그림 3)입니다. </li></ol> 4. PCR 제품 정화 단지 PCR 양성 샘플은 정화되어야합니다. 정화는 사용이 수행됩니다상용 키트 다음과 같은 제조 업체의 지침 (PureLink PCR microkit, Invitrogen, 칼스 배드 CA, 미국). <ol><li> PCR 제품의 1 볼륨 당 이소프로판올를 포함하는 바인딩 버퍼 4 볼륨을 추가합니다. </li><li> 열 바인딩 버퍼와 PCR 제품을 전송합니다. </li><li> RT에서 10,000 RCF에서 1 분 원심 분리기. </li><li> 에탄올을 포함 씻어 버퍼와 컬럼을 씻으십시오. </li><li> RT에서 10,000 RCF에서 1 분 원심 분리기. </li><li> 실리카 막 건조하고 에탄올과 잔여 씻으 버퍼를 제거하는 RT에서 1 분 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> ultrapure 물 10 μL를 추가합니다. </li><li> RT에서 1 분 알을 품다. </li><li> 정화 DNA를 수집하기 위해 RT에서 2 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. </li></ol> 5. 복제 Lysogeny 맛을 (LB) 플레이트 준비 <ol><li> 물을 약 800 ML에 LB 믹스 25 GR을 디졸브. </li><li> 1 L.로 최종 볼륨을 가지고 </li><li> Bactoagar 15 GR을 추가합니다. </li><li> 20 분 압력솥. </li><li> autoclaving 후에 적극적으로 소용돌이 술병의 솔루션은 녹은 한천을 섞어. </li><li> 50 ° C.에 대한 해결책을 쿨 </li><li> 암피실린 (50 μg / ML)와 소용돌이가 해체까지를 추가합니다. </li><li> 약 3mm의 깊이로 번호판을 하거라. </li><li> 상온에서 접시를 둡니다. </li><li> 37 각 LB 판과 부화에 확산 X - 걸 (40mg/ml)와 IPTG (100 ㎜) ° C 사용할 준비까지. </li></ol> 관할 셀 변환 변환은 상용 키트 다음과 같은 제조 업체의 지시 사항을 (토포 TA 클로닝 키트, Invitrogen, 칼스 배드 CA, 미국)를 사용하여 수행됩니다. <ol><li> 복제 반응 믹스 (신선한 PCR 제품 1-4 μL, 소금 용액 1 μL, 벡터 및 물 필요한 경우 1 μL) 준비합니다. </li><li> 부드럽게 반응을 혼합하고 RT에서 5-10분 위해 알을 품다. </li><li> 얼음에서 반응을 놓으십시오. </li><li> 관할 세포의 유리병으로 복제 반응 2 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 30 분 얼음에 품어. </li><li> 42 30 초 동안 열 충격 세포 ° C. </li><li> 즉시 얼음에 튜브를 전송합니다. </li><li> 중간 250 μL를 추가합니다. </li><li> tighly 튜브 캡 37에서 수평 튜브를 흔들 ° C를 1 시간. </li><li> prewarmed 선택 접시에 각각의 변환부터 50 μL를 벌리고. </li><li> 37 밤새 품어 ° C. </li></ol> 다음 부화, 흰색과 파란색 식민지가 접시에 개발할 수 있습니다. 화이트 식민지는 PCR 제품 삽입에 대한 긍정이며, 파란색 식민지 PCR 제품 삽입에 대해 아무것도 없습니다. 6. 시퀀싱 분석 시퀀싱 반응 <ol><li> 2,5 μl DNA 1 μl 프라이머 (μl / 5pmol) 1,1 μl BigDye (응용 Biosystem, 포스터 시티, CA, 미국) : 믹스는이 시약을 사용하여 이루어집니다. </li><li> 자전거 타는 사람 열 조건 : 96 ° 일분에 대한 C, 4 분 15 초 및 60 ° C 10 초, 55 ° C에 대해 96 ° C 25 번. </li></ol> 열 정제 <ol><li> 각 반응 들어, 하나의 MicroSpin 칼럼 (Qiagen, 밀란, 이탈리아)를 준비합니다. </li><li> 수지를 섞어 열과 와동 반전. </li><li> 칼럼의 맨 아래를 뜯어보면, ¼ 뚜껑을 느슨하게 설정하고, microcentrifuge 관에서 개최 칼럼. </li><li> 1 분 3,200 RPM을 원심 분리기. </li><li> 깨끗한 microcentrifuge 튜브에 열을 전송. </li><li> 조심스럽게 pipet 칼럼의 중심에 전체 배열 PCR 반응. </li><li> 1 분 3,200 RPM을 원심 분리기. </li><li> 정화의 DNA는 튜브 (ultrapure 물 20 μl)에 eluite합니다. </li></ol> 시퀀싱 분석 <ol><li> 96 multiwell 판에 정화 샘플 (20 μl)을로드합니다. </li><li> 시퀀서에 접시를로드합니다. 자동 DNA의 Sequencers은 시퀀스 실행의 결과를 보여주는 4 색 크로마토 그램을 생성합니다. </li><li> 공개 시퀀스 데이터베이스에 대한 쿼리로 뉴클레오 티드 시퀀스 입력. 검색은 기본 지역 정렬 검색 도구 (BLAST)와 함께 NCBI 데이터베이스 및 서버에서 수행됩니다. </li><li> 98~100%의 homologies에서만 박테리아를 고려하십시오. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 절차의 타임 라인. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 전체 세균성 식별 절차의 흐름 차트. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 광범위한 범위 16 rRNA 유전자 PCR 제품을 보여주는 2% 아가로 오스 겔. 레인 1은 100bp의 DNA 사다리를 포함, 레인 2 PCR 긍정적인 컨트롤을 포함, 레인 3 부정적인 PCR 컨트롤을 보여줍니다. 레인 4 HIV 양성 환자에서 샘플을 보여줍니다, 그리고 레인 5 물이 포함되어 있습니다. 레인 6 쉬건강한 개인 및 부정적인 PCR 반응에서 ows 샘플, 레인 7 물이 포함되어 있습니다. 만이 HIV 양성 환자는 긍정적인 PCR 증폭을 표시합니다. 추출 단계에서 대조군으로 사용 Ultrapure의 물, 오염이 발생 없다는 것을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 플라스미드 보여주는 그림 4. 0.7 % 아가로 오스 겔은 miniprep 절차를 추출. 레인 1 1 Kilobase의 DNA를 사다리를 포함, 레인 2 블루 제어 식민지, 12 3 백색 식민지를 포함하는 차선을 포함하고 있습니다. 파란 식민지에서 플라스미드는 PCR 제품의 삽입을 포함하지 않습니다. 총 10 개의 백색 식민지는 올바른 삽입과 플라스미드가 포함되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 하나 HIV 양성 개인의 플라즈마 세균 시퀀싱 분석의 예를 보여줍니다. 우리의 결과는 HIV 질환에서 미생물의 translocation이 세균 translocation을 제어에 창자가 면역의 실질적인 실패를 제안 HIV - 부정적인 과목에서 볼 수없는 polimicrobic 식물을, 포함 것으로 나타났습니다.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<p class="jove_content"&gt; 우리는 이에 HIV에 감염된 개인의 주변 혈액에 박테리아의 translocation을 특성화하기 위해 PCR / 시퀀싱 프로토콜을 보여줍니다.</p&gt;<p class="jove_content"EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 함유 튜브에 수집한 플라즈마를 사용하는 경우&gt; 대부분의 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있습니다. 혈액 샘플링 후, 플라즈마는 haemolysis 및 DNA 조각 저하를 피하기 위해, 3분의 2 시간 이내에 원심 분리로 구분해야합니다. 샘플은 -80에서 다음 약 5 일 ° C.위한 -20 ° C에서 첫째 저장됩니다 박테리아 DNA의 손실이 발생할 수 있음을 여러 동결과 해동 사이클은 피해야한다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 플라즈마 샘플은 해동 후 12 시간 이내에 사용해야합니다.</p&gt;<p class="jove_content"DNA 추출 프로토콜&gt; 최적화는 기증자 &#39;말초 혈액에서 DNA의 최대 수량을 얻기 위해 수행되었다. 후자는 또...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Easty - DNA 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K 180,001 </td><td></td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> UltraPure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> 라이 소 자임 </td><td> Fluka </td><td> 62,970 </td><td> 10 Distillated 물에 μg / ML </td></tr><tr><td> AmpliTaq 골드 </td><td> 응용 Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon 100 </td><td> Millipore </td><td> 42,413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 사다리 </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR 마이크로 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> LB 아가르, 분말 </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 Distillated 물에 MG / ML </td></tr><tr><td> X - 여자 </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> DMF에 40mg/mL </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> Distillated 물속에 100mM </td></tr><tr><td> 토포 TA 클로닝 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink 빠른 플라스미드 Miniprep 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> 빅 염료 </td><td> 응용 Biosystem </td><td> 4,337,455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2.0 스핀 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 63,204 </td><td></td></tr></tbody></table>

주변 혈액에 세균 microflora의 시퀀싱 : hiv에 감염된 환자 경험

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

건강한 위장관은 생리학적으로 체액성 및 세포 점막 면역 시스템 1,2의 발전에 영향을 공생 미생물의 큰 다양성에 의해 식민지입니다. Microbiota은 강한 점막 장벽을 통해 면역 시스템에서 격리됩니다. 감염 및 항생제는 정상적인 위장관의 장벽 가능한 면역 이상에 3 발생할 수 있습니다 상주 세균의 구성을 모두 변경하는 것으로 알려져 있습니다. HIV는 면역 체계 활성화 4-7에 기여하는 등 lipopolysaccharide와 박테리아 DNA 조각과 같은 세균 bioproducts,의 체계 순환에 점막 면역 및 누설의 진보적인 장애와 위장 장애에 위반됩니다. 미생물 translocation은 HIV / AIDS immunopathogenesis 및 치료 4,8에 대한 응답으로 연관되어 있습니다. 우리는 HIV에 감염된 환자의 말초 혈액에 translocating 박테리아의 구성을 특징으로 목표. 우리의 목표를 추구하기 위해 우리는 시퀀싱 분석을 다음 panbacteric 16 ribosomial 유전자에 대해 PCR 반응을 설정합니다. 간단히, 모두 HIV에 감염된 건강한 과목에서 전체 혈액이 사용됩니다. 건강한 개인이 정상적인 창자 항상성을 제시 것을 감안할 때 microflora에 대한 translocation 이러한 환자에서 예상되지 않습니다. venipuncture와 플라즈마 분리하여 전체 혈액 컬렉션을 따라 DNA는 플라즈마에서 추출 및 유전자 9 ribosomial panbacteric 16에 대한 광범위한 PCR 반응을 수행하는 데 사용됩니다. 다음 PCR 제품 정화, 복제 및 시퀀싱 분석이 수행됩니다.

우리의 실험은 HIV 양성 환자의 말초 혈액에서 translocating 세균 종의 시퀀싱 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.

주변 혈액에 세균 Microflora의 시퀀싱 : HIV에 감염된 환자 경험

건강한 위장관은 생리적으로 매우 다양한 상주 미생물에 의해 군집화되어 있으며, 이들은 체액성 면역의 발달에 영향을 미칩니다...

말초 혈액으로 전이되는 세균성 미생물군집의 시퀀싱입니다. HIV 감염 환자를 대상으로 한 저희의 연구 경험을 바탕으로, 저는 밀라노 대학교 감염병 및 열대 의학 클리닉의 조교수인 주니어 마티입니다. 이제 HIV 감염 환자의 말초 혈액에서 세균 DNA를 검출하고 시퀀싱하는 실험 방법을 보여드리겠습니다.건강한 위장관에는 체액성 및 세포성 점막 면역 체계의 발달에 영향을 미치는 매우 다양한 상주 미생물이 군집을 이루고 있습니다. 미생물군은 강력한 점막 장벽을 통해 면역 체계로부터 보호되지만, 감염, 항생제 치료, 수술 후 합병증뿐만 아니라 암, 췌장염, 영양실조 환자와 같은 여러 임상 상태에 따라 위장관의 변화가 일어납니다.HIV 감염은 위장관 장벽의 붕괴를 유발하며, 이는 점막 면역의 점진적인 기능 부전과 리포폴리사카라이드 및 박테리아 DNA 단편과 같은 박테리아 생물학적 생성물의 전신 순환계 유출로 이어집니다. 이러한 현상은 전신 면역 활성화의 원인이 되며, 본 영상에서는 박테리아 DNA의 검출 및 시퀀싱의 실험 단계를 시연합니다. HIV 감염 환자의 말초 혈액 내 존재 여부를 확인하기 위해 밀라노 대학교 감염병 및 열대 의학 클리닉 소속의 감염병 전임의 Camilla ti, 박사 과정 학생 Esther me, 박사 후 연구원 ju MariaI가 참여합니다. 본 실험의 목적은 HIV 감염 환자의 말초 혈액 샘플에서 박테리아 종을 식별하는 것입니다.건강한 개인은 정상적인 장내 항상성을 나타내므로, HIV 감염자와 건강한 피험자 모두의 전혈을 사용할 것입니다. 건강한 피험자들에게서는 전이되는 미생물군집이 관찰되지 않을 것으로 예상합니다. 환자로부터 전혈을 채집한 후 혈장을 분리하겠습니다.그 다음, PCIC 16 s 리보솜 유전자에 대한 광범위 PCR 반응을 수행하기 위해 DNA를 추출합니다. PCR 산물 생성 후, 정제, 클로닝 및 서열 분석을 수행합니다. 본 실험의 첫 번째 단계는 정맥 천자를 통한 혈액 채취이며, 이어서 혈장 분리를 진행합니다.EDTA가 포함된 튜브에 약 9 mL의 전혈을 채취합니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 2000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 실온에서 원심분리를 수행하여 혈장을 분리합니다.이제 혈장 샘플에서 DNA를 추출하겠습니다. 멸균 상태를 보장하기 위해 후드, 피펫 및 실험에 필요한 재료를 적절히 소독하며, 모든 재료를 UV 램프 아래에 최소 30분 동안 둡니다. UV 램프를 끄고, 소독제로 장갑을 닦은 후, 종이 타월 몇 장을 에탄올에 적셔 팁을 버릴 때마다 후드 아래에 배치합니다. DNA 추출 과정 동안 피펫을 젖은 종이 타월로 닦아줍니다.이제 DNA 추출을 준비합니다. DNA는 제조사의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 추출합니다. 간단히 설명하면, 350 µL의 혈장을 2 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.초순수를 음성 대조군으로 사용합니다. 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 리소좀 10 µL를 시료에 첨가합니다. 그 후 시료를 30분 동안 배양합니다.원심분리 후, 지침에 따라 37°C에서 용액 A, 클로로포름 및 용액 B를 시료에 첨가합니다. 그러면 세 개의 뚜렷한 층이 나타납니다. 상층액을 수집하여 에탄올에 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.다음 단계는 PRIC 16 s 리보솜 유전자를 증폭하기 위한 광범위 PCR 반응으로, 전용 실험실에서 수행됩니다. 다음과 같은 시약들을 사용하여 PCR 믹스를 제조합니다. 박테리아 Taq polymerase에 의한 잠재적 오염을 방지하기 위해, PCR 믹스를 4 °C에서 500 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.그런 다음 PCR 믹스를 분주합니다. 증폭이 필요한 샘플 수에 맞추어 분주하십시오. 이때 음성 및 양성 반응 대조군을 위한 분주량도 반드시 고려하시기 바랍니다.써모사이클링(THERMOCYCLING)은 다음과 같은 조건으로 설정합니다. 94 °C에서 5분, 이어서 94 °C, 55 °C, 72 °C에서 각각 1분씩 40회 반복하고, 마지막으로 72 °C에서 10분간 수행합니다. 평균 소요 시간은 3시간입니다.PCR 생성물은 2% AGROS 겔에서 시각화합니다. 이것은 PCR 생성물을 보여주는 2% agros 겔입니다. 첫 번째 레인에는 100 base pair 래더가 포함되어 있습니다.두 번째 레인은 PCR 양성 대조군입니다. 세 번째 레인은 PCR 음성 대조군을 포함하고 있습니다. 네 번째 레인은 HIV 양성 환자의 샘플을 보여주며, 다섯 번째 레인은 증류수 레인을 포함합니다.6번 레인은 건강한 개인의 샘플과 음성 PCR 반응을 보여줍니다. 7번 레인에는 물이 포함되어 있습니다. 다음 단계는 PCR 확인 과정입니다.제조사의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제합니다. 이 단계에서는 필터가 포함된 여러 개의 컬럼이 사용됩니다. PCR 결과는 작업 시트에 기록합니다.이제 블루-화이트 스크리닝(blue-white screen)을 이용한 클로닝을 진행하겠습니다. 이는 벡터로의 DNA 라이게이션 성공 여부를 검출할 수 있게 해주는 분자생물학적 기법입니다. 벡터는 컴피턴트 셀(competent cells)인 박테리아로 형질전환됩니다.수용성 세포를 X-gal이 포함된 배지에서 배양합니다. 형질전환에 성공하면 박테리아 콜로니는 흰색으로 나타납니다. 성공하지 못한 경우 콜로니는 파란색으로 나타납니다.X-gal은 세포가 베타-갈락토시다아제(beta galacto aase) 효소를 발현하는지 여부를 나타내고 대장균(e coli) 콜로니의 형질전환을 시각화하는 데 사용되며, IPTG는 베타-갈락토시다아제(beta galacto. Aase)의 발현을 유도합니다. X-gal과 IPTG를 암피실린이 포함된 플레이트에 도포하여 섞어줍니다. 제조사의 지침에 따라 PCR 산물, SALT 및 클로닝 벡터가 포함된 클로닝 혼합물을 준비합니다.E coli 세포를 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 클로닝 믹스를 세포에 첨가하고, 열 충격 처리 후 평판에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 평판 위에 흰색과 파란색 콜로니가 형성됩니다.흰색 콜로니는 PCR 산물이 삽입된 양성 결과이며, 푸른색 콜로니는 PCR 산물이 삽입되지 않은 음성 결과입니다. 10개의 흰색 콜로니와 1개의 푸른색 콜로니를 선택합니다.각 콜로니를 2 mL의 액체 LB 배지에 넣습니다. ampicillin이 첨가된 배지에서 콜로니를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 하룻밤 동안 성장한 콜로니를 상용 mini prep 키트를 사용하여 플라스미드 추출에 사용합니다.필터가 포함된 미니 컬럼이 이 단계에 사용됩니다. 플라스미드 추출 후, 플라스미드를 0.7%AROS 겔 상에서 시각화합니다. 이것은 미니 프렙(mini prep) 생성물을 보여주는 0.7%AROS 겔입니다. 첫 번째 레인에는 1kb 래더(ladder)가 포함되어 있습니다.두 번째 레인에는 파란색 대조군 콜로니가 포함되어 있습니다. 세 번째부터 12번째 레인까지는 흰색 콜로니가 포함되어 있습니다. 결과는 작업 시트에 기록하며, 이어지는 시퀀싱 단계에서 플라스미드를 증폭합니다.이러한 시약들을 사용하여 혼합물을 제조합니다. PCR 혼합물을 증폭이 필요한 시료 수에 맞춰 분주합니다. 열순환 조건은 96 °C에서 1분, 96 °C에서 10초, 50 °C에서 5초, 60 °C에서 4분으로 설정합니다.25회 사이클 동안 진행합니다. 평균 소요 시간은 약 1시간입니다. 증폭 후, 필터가 포함된 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.정제된 생성물을 플레이트에 로딩한 후, 이를 시퀀서에 넣습니다. 시퀀싱 서열이 확보되면 blast를 실행하여 각 콜로니의 박테리아 종을 식별합니다. 98%에서 100%의 서열 상동성을 보이는 콜로니를 양성으로 간주합니다.이는 HIV 양성 환자 한 명의 혈장 내 박테리아 시퀀싱 예시입니다. 연구 결과, HIV 질환의 미생물 전위(microbial translocation)에는 다종 미생물총이 관여한다는 것이 밝혀졌습니다. 이로써 우리는 HIV 감염 환자의 전신 순환계에 높은 다종 미생물 미크로플로라(microflora)가 존재함을 확인하였습니다.HIV 음성인 건강한 대조군 개체들의 말초혈액 내 세균 DNA는 검출 한계 미만이었으며, 이는 위장관의 무결성을 반영하는 것일 수 있습니다. 현재 저희 연구는 말초혈액 내 미생물군이 HIV 면역병인세 및 잠재적인 치료 반응 조절에 미치는 가능한 역할을 이해하고 조사하는 데 집중하고 있습니다.

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의학

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

배우세요 HIV 감염 환자의 주변 혈액에서 세균 DNA를 검출하고 시퀀싱하는 방법을. 이 기술은 미생물 이동과 면역 반응의 관계를 이해하는 데 도움을 줍니다.

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