높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

이 절차의 전반적인 목표는 플라스미드 DNA 어레이 라이브러리를 효모 세포에 형질전환시키는 것입니다. 이는 먼저 적절한 양의 효모 세포를 배양함으로써 수행됩니다. 그 다음, 효모 세포를 아세트산 리튬으로 처리하여 DNA 형질전환이 가능하도록 수용성 세포(competent cells) 상태로 만듭니다.

다음으로, DNA와 혼합하여 수용성 e 세포를 형질전환합니다. 이 절차의 마지막 단계는 형질전환체를 선택하고 분석하는 것입니다. 최종적으로, 효모 스포팅 분석 및 또는 현미경 관찰을 통해 플라스미드 DNA가 효모 표현형에 미치는 영향을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

표준 효모 형질전환과 같은 기존 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수많은 서로 다른 플라스미드를 효모 세포로 자동화된 방식으로 형질전환할 수 있다는 점입니다. 이 고처리량 효모 형질전환 프로토콜은 96웰 플레이트 10개를 기준으로 설계되었으나, 필요에 따라 규모를 확대하거나 축소할 수 있습니다. 대규모 실험의 경우, 모든 플레이트와 시약을 체계적으로 정리하는 것이 성공의 핵심입니다.

혼동을 방지하기 위해 실험이 시작되면, 이 프로토콜에서는 BioBot rapid plate liquid handler가 사용됩니다. 우선, 어레이 효모 플라스미드 라이브러리에서 얻은 플라스마 DNA 5~10 µL를 라운드 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오. 96웰 플레이트를 덮개 없이 클린 벤치 흄 후드 내부에 두고 하룻밤 동안 건조시키십시오.

다음으로, 500 mL 배플 린마이어 플라스크(baffled Lin Meyer flask)에 담긴 200 mL의 효모 펩톤 포도당(yeast peptide dextrose) 또는 YPD 배지에 쿼리 균주를 접종하고, 30 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 최적의 성장을 위해 2 L의 YPD 배지에서 쿼리 균주의 OD 600 수치가 0.1이 되도록 희석합니다. 별도의 2.8 L 배플 플라스크에서 1 L의 배양액까지 증식시킵니다.

배양액의 OD 600 수치가 0.8에서 1.0에 도달할 때까지 30 °C에서 4~6시간 동안 플라스크를 흔들어 배양합니다. 효모 배양액의 OD 600 수치가 0.8에서 1.0에 도달하면, 원심분리를 통해 세포를 회수합니다. 225 mL 일회용 원뿔형 튜브 4개에 배양액을 채우고, 탁상형 원심분리기에서 3000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.

각 튜브에서 S 상층액을 따라냅니다. 동일한 튜브에 배양액을 더 추가하고 다시 원심분리하며, 모든 세포가 수집될 때까지 필요에 따라 이 과정을 반복합니다. 각 세포 펠렛을 50 milliliters의 오토클레이브 멸균 증류수로 세척하고 볼텍싱하여 재현탁합니다.

세포를 하나의 225 mL 원추형 튜브에 모으고 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 100 mL의 리튬 아세테이트 용액으로 세포를 세척합니다. 다시 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

SNA를 제거하고 세포 펠렛을 70 milliliters의 리튬 아세테이트 용액에 재현탁합니다. 펠렛이 완전히 재현탁될 때까지 약 30초 동안 고속으로 볼텍싱합니다. 30 degrees Celsius에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.

다음으로, 0.1 M beta-mercaptoethanol을 추가하고 30 °C에서 30분 동안 흔들어주며 추가로 배양합니다. 30분간의 배양 후, 끓인 다음 식힌 연어 정자 DNA 2 mL를 세포 혼합물에 추가합니다. 세포 혼합물을 오토클레이브 가능한 싱글 웰 플레이트에 붓고, 이후의 피펫팅 과정을 방해할 수 있으므로 형성된 침전물을 모두 제거합니다.

biobot rapid plate를 사용하여, 이전에 준비한 plasma DNA가 포함된 4개의 96-well plate의 각 웰에 세포 혼합물 50 µL를 분주합니다. 이때 혼합하지 마십시오. 세포가 배양되는 동안 plate를 실온에서 30분 동안 흔들지 않고 배양합니다.

200 mL의 PEG DMSO 리튬 아세테이트 용액을 준비합니다. 50% PEG 3350 160 mL, DMSO 20 mL 및 1 M 리튬 아세테이트 20 mL를 혼합합니다. 이 용액은 사용 직전에 준비하는 것이 중요합니다.

각 시료에 125 µL의 PEG lithium acetate DMSO 용액을 추가합니다. 세포 현탁액을 8회 흡입 및 분사하여 충분히 혼합합니다. 흔들지 않은 상태로 상온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 건조 배양기에서 42 °C로 15분 동안 세포에 열 충격을 줍니다. 열 충격 후에는 플레이트를 겹쳐 쌓지 말고, 96-웰 플레이트용 원심분리기 어댑터를 사용하여 플레이트를 회전시킵니다. 원심분리가 끝나면 플레이트를 폐기물 통 위로 뒤집어 PEG 용액을 제거합니다. 그런 다음 뒤집힌 플레이트를 종이 타월로 닦아냅니다.

잔류 액체를 제거하고 세포가 웰 바닥에 남아 있게 합니다. 각 웰에 200 µL의 최소 배지를 추가하여 세포를 헹굽니다. 플레이트를 다시 원심 분리합니다.

폐기물 수거함 위에서 튜브를 뒤집어 상층액을 제거하고 페이퍼 타월로 흡수시킵니다. 신속 플레이트 인큐베이터를 사용하여 각 웰에 200 µL의 최소 배지를 넣고 30 °C에서 2일 동안 진탕 없이 배양합니다. 2일 후, 형질전환이 성공적으로 이루어진 각 웰의 바닥에서 작은 세포 콜로니가 형성되기 시작해야 합니다.

Spatting 분석을 준비하려면, 먼저 새로운 평저 96-웰 플레이트의 각 웰에 OSE 기반 최소 배지 200 µL를 분주합니다. 다음으로, 멀티 채널 파이펫을 사용하여 세포 현탁액을 여덟 번 흡입 및 분주함으로써 형질전환 플레이트의 각 웰을 혼합합니다.

라피노스 플레이트의 각 웰에 형질전환 플레이트의 세포 혼합물 5 µL를 접종하고, 30 °C에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 각 웰의 바닥에 작은 콜로니가 형성되어 있어야 합니다.

후드 내에서 스포팅 분석(spotting assay)을 수행하며, 화염 멸균을 통해 96핀 복제기(replicator) 또는 프로거(frogger)를 멸균합니다. 프로거를 사용하여 콜로니를 혼합한 다음, 선택 배지 플레이트에 콜로니를 스포팅합니다. 스포팅 후에는 후드 내에서 5~10분 동안 플레이트를 건조시킵니다.

플레이트를 30°C에서 2~3일 동안 배양합니다. 여기 제시된 결과는 TDP-43 독성의 억제제 및 강화제를 식별하기 위한 효모 플라스미드 과발현 스크리닝의 대표적인 결과입니다. TDP-43은 근위축성 측색 경화증 또는 루게릭병의 병인에 관여하는 인간 단백질이며, 효모 세포에서 TDP-43을 발현시키면 응집 및 세포 독성이 발생합니다.

이 플레이트들은 galactose 유도성 T DP 43 플라스미드가 통합되어 있으며, flex 유전자 ORF 발현 라이브러리의 플라스미드로 또한 형질전환된 콜로니들을 보여줍니다. 여기서 콜로니들이 붉은색으로 보이는 이유는 해당 균주가 적색 색소 축적을 일으키는 돌연변이를 가지고 있기 때문입니다. 왼쪽 플레이트에는 glucose가 포함되어 있어, T DP 43 또는 flex 유전자 플라스미드의 발현을 억제합니다.

오른쪽 플레이트에는 갈락토스가 포함되어 있으며, 이는 flex 유전자 플라스미드 내 TDP 43 및 O Fs의 발현을 유도합니다. 녹색 화살표는 더 빠른 성장과 더 조밀한 콜로니로 나타나는, TDP 43의 독성을 억제하는 플라스미드가 형질전환된 콜로니를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 더 느린 성장과 덜 조밀한 콜로니로 나타나는, TDP 43의 독성을 강화하는 플라스미드가 형질전환된 콜로니를 나타냅니다.

이 영상을 시청하고 나면, 세포로부터 혈장 DNA의 어보이드 라이브러리를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.