높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

이 절차의 전반적인 목표는 플라즈마 DNA의 어레이 라이브러리로 효모 세포를 형질전환시키는 것입니다. 이것은 먼저 적절한 양의 효모 세포를 성장시킴으로써 달성됩니다. 그런 다음 효모 세포를 리튬 아세테이트로 처리하여 DNA 형질전환에 적합하게 만듭니다.

다음으로, 유능한 e 세포를 DNA와 혼합하여 형질전환시킵니다. 절차의 마지막 단계는 형질전환체를 선택하고 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 효모 탐지 분석 및/또는 현미경 검사를 통해 효모 표현형에 대한 혈장 DNA의 효과를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

표준 효모 형질전환과 같은 기존 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 자동화된 방식으로 많은 수의 서로 다른 플라스미드를 효모 세포로 형질전환할 수 있다는 것입니다. 이 고처리량 효모 변환 프로토콜은 10개의 96웰 플레이트용으로 설계되었지만 그에 따라 확장 또는 축소할 수 있습니다. 대규모 실험의 경우 성공의 열쇠는 모든 플레이트와 시약을 정리된 상태로 유지하는 것입니다.

혼동을 피하기 위해 실험이 진행되면 이 프로토콜에 바이오봇 신속 플레이트 액체 처리기가 사용되어 어레이 효모 플라스미드 라이브러리에서 5-10마이크로리터의 혈장 DNA를 라운드의 각 웰로 분취를 시작합니다. 하단 96웰 플레이트. 덮개를 덮지 않은 96개의 웰 플레이트를 깨끗한 벤치 흄 후드 안에 밤새 놓고 건조시킵니다.

다음으로 200ml의 효모, 펩타이드, 포도당 또는 YPD 배지를 500ml의 당황한 Lin Meyer 플라스크에 쿼리 균주로 접종하고 다음 날 아침 진탕하면서 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 최적의 성장을 위해 쿼리 변형률을 2리터의 YPD 매체에서 0.1의 OD 600으로 희석합니다. 별도의 2.8리터 배플 플라스크에서 최대 1리터 배양까지 성장합니다.

배양액이 0.8에서 1.0의 OD 600에 도달할 때까지 섭씨 30도에서 4-6시간 동안 플라스크를 흔듭니다. 효모 배양액이 0.8 내지 1.0의 OD 600에 도달하면 원심분리로 세포를 수확합니다. 4개의 일회용 225ml 원뿔형 튜브를 배양물로 채우고 탁상용 원심분리기에서 3000RPM을 5분 동안 회전시킵니다.

각 튜브에서 S 상등액을 붓습니다. 동일한 튜브에 더 많은 배양액을 추가하고 다시 원심분리하고 모든 세포가 수확될 때까지 필요에 따라 반복합니다. 각 세포 펠릿을 50ml의 오토클레이브 증류수로 세척하고 Resus는 볼텍싱으로 사용합니다.

1 225 밀리리터 원뿔형 튜브에 세포를 결합하고 3000 RPM으로 5 분 동안 회전합니다. S 상등액을 제거한 후 100 밀리리터의 리튬 아세테이트 용액으로 세포를 씻으십시오. 3000RPM으로 5분 동안 다시 돌립니다.

SNA를 제거하고 70ml의 리튬 아세테이트 용액에 셀 펠릿을 재현탁합니다. 펠릿이 완전히 재현 될 때까지 약 30 초 동안 고속으로 소용돌이칩니다. 섭씨 30도에서 30분 동안 흔들면서 배양합니다.

다음으로, beta me capto 에탄올을 0.1몰 배양액에 첨가하고 섭씨 30도에서 30분 더 흔들어 배양합니다. 30분 배양 후 삶은 연어와 식힌 연어 정자 DNA 2ml를 세포 혼합물에 추가합니다. 세포 혼합물을 오토클레이브 가능한 단일 웰 플레이트에 붓고, 다운스트림 피펫팅을 방해할 수 있으므로 형성되는 침전물을 제거합니다.

바이오봇 래피드 플레이트를 사용하여 50마이크로리터의 세포 혼합물을 이전에 제조된 4개의 각 웰에 분취합니다. 혈장 DNA를 포함하는 96웰 플레이트는 혼합되지 않습니다. 세포가 배양하는 동안 흔들리지 않고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.

PEG DMSO 리튬 아세테이트 용액 200ml를 준비합니다. 160 밀리리터의 50%PEG 33, 50 20 밀리리터의 DMSO 및 20 밀리리터의 1몰 리튬 아세테이트를 결합합니다. 이 용액은 사용 직전에 준비하는 것이 중요합니다.

각각에 125마이크로리터의 PEG 리튬 아세테이트 DMSO 용액을 추가합니다. 세포 현탁액을 8번 흡인하고 분주하여 잘 혼합합니다. 흔들지 않고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 섭씨 42도에서 15분 동안 셀을 열 충격으로 가합니다.건식 인큐베이터에서 열 충격 후 플레이트를 쌓지 말고 96개의 웰 플레이트를 수용할 수 있도록 원심분리기 어댑터를 사용하여 플레이트를 회전시킵니다. 원심분리 후 쓰레기통 위에 플레이트를 뒤집어 PEG 용액을 제거합니다. 그런 다음 거꾸로 된 접시를 종이 타월로 닦아냅니다.

잔류 액체를 제거하기 위해 셀은 우물 바닥에 남아 있습니다. 각각에 200마이크로리터의 최소 배지를 추가하여 세포를 헹굽니다. 글쎄, 접시를 다시 돌립니다.

쓰레기통 위에 뒤집어 종이 타월을 두드려 상층액을 제거합니다. 200마이크로리터의 최소 배지를 각 웰에 첨가하고 흔들림 없이 섭씨 30도에서 이틀 동안 빠르게 플레이트를 배양합니다. 이틀 후, 성공적으로 변형된 각각의 바닥에 작은 세포 군락이 형성되기 시작해야 합니다.

스패팅 분석을 준비하기 위해 먼저 200마이크로리터의 OSE 기반 최소 매체를 새 플랫의 각 웰에 분배합니다. 하단 96웰 플레이트. 다음. 세포 현탁액을 급속 플레이트로 8회 흡인 및 분주하여 형질전환 플레이트의 각 웰을 혼합합니다.

형질전환 플레이트에서 5마이크로리터의 세포 혼합물을 라피노스 플레이트의 각 웰에 접종하고 섭씨 30도에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날에. 작은 군체는 각각의 바닥에 있어야 합니다.

후드에서 스포팅 분석을 잘 수행하고 96 볼트, 복제기 또는 개구리를 화염으로 살균합니다. 식민지를 개구리와 혼합한 다음 선택적 미디어 플레이트에서 식민지를 찾습니다. 얼룩이 생긴 후에는 후드에서 플레이트를 5-10분 동안 건조시킵니다.

플레이트를 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양합니다. 다음은 TDP 43.Toxicity의 억제제 및 강화제를 식별하기 위한 효모 플라스미드 발현 스크리닝에 대한 대표적인 결과입니다. TDP 43은 근위축성 측삭 경화증 또는 루게릭병의 발병기전에 연루된 인간 단백질로, 효모 세포에서 TDP 43을 발현하여 응집 및 세포 독성을 일으킵니다.

이 플레이트는 갈락토오스 유도성 T DP 43 플라스미드가 통합된 콜로니를 표시하며, 이 콜로니는 플렉스 유전자 ORF 발현 라이브러리의 플라스미드로 형질전환되었습니다. 이곳의 군체는 붉은색으로 보이는데, 그 이유는 그 균주가 붉은 색소를 축적하는 돌연변이를 가지고 있기 때문입니다. 왼쪽의 플레이트에는 T DP 43 또는 플렉스 유전자 플라스미드의 발현을 억제하는 포도당이 포함되어 있습니다.

오른쪽 플레이트에는 플렉스 유전자 플라스미드에서 TDP 43 및 O Fs의 발현을 유도하는 갈락토오스가 포함되어 있습니다. 녹색 화살촉은 더 빠른 성장과 더 조밀한 콜로니로 표시된 TDP 43의 독성을 억제하는 플라스미드로 변형된 콜로니를 나타냅니다. 빨간색 화살촉은 느린 성장과 덜 조밀한 콜로니로 표시된 바와 같이 TDP 43의 독성을 향상시키는 플라스미드로 변형된 콜로니를 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 세포의 혈장 DNA 라이브러리를 변환하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.