마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

이 실험 절차의 전반적인 목표는 실험적 조작 후 제2 감수분열 중기 난자의 염색체 배치를 평가하는 것입니다. 먼저 성적으로 성숙한 프라이밍된 암컷 쥐로부터 완전히 성장한 난모세포를 수집하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 관심 단백질을 교란하기 위해 선택한 물질을 난모세포에 미세 주입하고, 이를 시험관 내(in vitro)에서 제2 감수분열 중기까지 성숙시킵니다. 다음으로, 단극성 방추사를 형성하게 하는 mantro 처리를 통해 난자의 염색체 확산을 유도합니다.

최종적으로, 이러한 결과는 면역형광법과 공초점 현미경을 통해 난자의 배수성 상태를 묘사할 수 있습니다. 이 방법은 유동성을 유발하는 분자적 메커니즘을 이해하는 것과 같이 생식 생물학 및 염색체 분리 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미세 주입 기술은 글로 전달하기 어려운 단계들이 많아 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 각 생쥐로부터 분리되는 난포의 수를 최대화하기 위해, 성숙한 암컷 생쥐의 복강 내에 5 IU의 임신마 혈청 성선 자극 호르몬을 주입하십시오.

PMSG 프라이밍 후 약 48시간이 지나면, 마우스 한 마리당 3 mL의 수집 배지를 37°C에서 가온하여 평형화합니다. 배양 배지 1 mL를 최소 1시간 동안 평형화합니다. 페트리 접시에 각각의 마이크로 드롭을 설정하고 미네랄 오일로 덮어줍니다.

이제 배양액 접시를 배양기에 넣고, 수집 배지 접시는 슬라이드 워머 위에 올립니다. 마우스를 희생시킨 후, 난소를 적출하여 미리 데워진 수집 배지가 담긴 시계 접시에 넣습니다.

1 mL 인슐린 주사기를 사용하여 난소를 디쉬에 고정하고, 서로 연결된 27 gauge 바늘로 난포를 여러 번 찔러 난포액이 든 난포(antral follicles)를 방출시킵니다. 해부 현미경 하에서 입으로 조작하는 유리 피펫을 사용하여 난구 세포 복합체(cumulus cyte complexes)를 수집합니다. 크기가 큰 난포액이 든 난포만 수집하며, 더 작은 전난포(pre antral follicles)나 난구 세포가 제거된 난모세포는 수집하지 않습니다.

난모세포의 직경보다 약간 더 큰 소형 피펫을 사용하여 복합체를 미리 준비된 수집 배지가 담긴 마이크로 드롭으로 옮깁니다. 복합체에서 난구 세포를 제거합니다. 제거된 난모세포를 더 큰 피펫을 이용해 배양액이 담긴 마이크로 드롭으로 옮깁니다.

조작 전 인큐베이터에서 난자가 최소 1시간 동안 회복되도록 합니다. 기계적 풀러(mechanical pull)를 사용하여 붕규산 유리 모세관 튜브를 당겨 주입용 피펫을 제작합니다. 1-웰 챔버 슬라이드에서 배양액 챔버를 제거합니다.

마이크로인젝션 플랫폼을 구축하려면, 수집 배지 5 µL 한 방울을 SIR N-A-C-R-N-A 또는 morph ol리고뉴클레오타이드 주입 물질 0.5 µL 한 방울에 최대한 가깝게 배치한 후 미네랄 오일로 덮고 현미경 스테이지 위에 올립니다. 주입 피펫과 유지 피펫을 홀더에 장착하고 수집 배지 방울 내에 위치시킵니다. 피코 인젝터와 제진대(anti-vibration table)에 연결된 질소 탱크를 켭니다.

배지를 채우는 동안 주입 피펫의 팁을 홀딩 피펫에 살짝 두드려 개방합니다. 인큐베이터에서 5~10개의 난자를 플랫폼 위의 수집 배지 방울로 옮깁니다. 이제 clear 버튼을 누르는 동안 피코 인젝터의 주입 부피 파라미터를 5~10 picoliters로 설정합니다.

주입 바늘을 재료 방울로 이동시켜 채웁니다. 다시 배양액 방울로 복귀시킵니다. 홀딩 피펫을 사용하여 난자를 잡고, 주입 바늘과 난자, 홀딩 피펫을 x축을 따라 정렬합니다.

더 높은 배율에서, 핵을 건드리지 않도록 주의하며 주입 피펫을 난자 내부로 전진시킵니다. 세포막을 관통하면 inject를 눌러 주입하고, 바늘을 뺀 후 난자를 놓아줍니다. 이 과정을 반복하십시오. 모든 난자에 주입이 완료되면, 난자들을 인큐베이터로 옮겨 배양액에서 원하는 시간(통상 12~24시간) 동안 배양합니다.

그 다음 CZB를 여러 방울 떨어뜨려 세포를 세척하고, 오일 아래의 CZB 미세 방울로 옮겨 감수 분열 2기 중기까지 성숙이 완료되도록 16시간 동안 배양합니다. 외곽 링에 물이 채워진 기관 배양 접시의 웰에 100 Micromolar Mastri가 포함된 CZB 750 microliters를 넣습니다. 이제 Mastri가 첨가된 CZB를 여러 방울 떨어뜨려 난자를 세척한 후, 기관 배양 접시로 옮겨 1시간 동안 배양합니다.

PBS에 2% paraformaldehyde가 포함된 시계접시(watch glass)에서 알을 실온에서 20분 동안 고정합니다. 그다음, 알을 블로킹 용액(blocking solution)으로 옮겨 4°C에서 보관한 후, 실온에서 15분 동안 알의 투과화(permeabilization) 처리를 진행합니다. 마지막으로 다량의 블로킹 용액으로 여러 번 헹굽니다.

나머지 절차는 가습 챔버 내에서 빛으로부터 차단된 96웰 플레이트 덮개 위에서 수행합니다. 상온에서 난자를 25 µL의 블로킹 용액 방울로 옮겨 15분 동안 둡니다. 그 다음, 중심절을 표지하기 위해 1:40으로 희석된 Crest Antiserum이 포함된 블로킹 용액 방울로 난자를 옮겨 최소 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 블로킹 용액 세 방울로 세척하며, 각 방울당 15분씩 배양합니다. 알을 fluoro four 접합 항체가 포함된 블로킹 용액 한 방울로 옮겨 한 시간 동안 배양합니다. 두 번 세척한 후, 염색체를 검출하기 위해 블로킹 용액을 처리합니다.

cytx green과 블로킹 솔루션을 1:5,000로 희석한 용액에서 인큐베이트하고, 5 µL의 vector shield를 사용하여 샘플을 마운트합니다. 알이 눌리는 것을 방지하기 위해 커버 슬립 모서리가 놓일 위치에 바셀린을 네 군데 소량 도포합니다. 커버 슬립을 덮고 매니큐어로 밀봉한 후, 공초점 현미경으로 분석할 때까지 4 °C의 슬라이드 박스에 보관합니다. 100x 대물렌즈로 이미징할 때 Z 평면에서 0.4 µm 간격으로 단계별 촬영을 수행하고, NIH의 Image J와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 중기 지역 전체를 촬영해 중심체를 계수합니다. 배수성이 정상인 생쥐의 난자는 20쌍의 kinetochore를 포함하고 있어, 이 배수성 중기 2기 난자의 Z-투영 이미지에서는 총 40개의 점이 나타납니다. DNA는 녹색으로, kinetochore는 적색으로 염색되었습니다.

화살표는 미세주입 절차 이후 17번 및 18번 kinetochore에서 중첩이 발생했음을 나타내는 두 개의 뚜렷한 염색체 팔을 가리킵니다. 관심 단백질의 섭동이 감수분열 성숙과 발달 잠재력에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 Western blotting, 실시간 PCR, 방추사 구성 및 염색체 정렬 평가, 그리고 체외 수정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 모든 부위를 조작하고 중기 II 세포의 PLO를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.