Name: 마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 학습하세요 마우스 MCAO 모델을 이용한 허혈성 뇌졸중 연구 방법과 레이저 도플러 혈류측정 기술을. 이 기법은 뇌졸중 메커니즘 연구와 치료 개발에 필수적인 도구입니다.

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이 프로토콜은 기관 애니멀 케어 승인 및 플로리다 대학에서위원회 (IACUC)를 사용하고 "연구소 동물 관리의 원리"(NIH 간행물 번호 86-23, 1985 개정) 준수가되었습니다. 1. 자료 <ol><li> 동물 : 수술 시에 20-26그램 무게 남성 C57BL / 6 마​​우스 (할렌 연구소, 인디애나 폴리스, IN, 미국). </li><li> 마취 : <ol><li> 마취 기계 : VetEquip의 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식 회사, 플레즌턴, CA, 미국). </li><li> 마취 흡입 : Isoflurane (백스터 조제학, 디어 필드, IL). </li></ol></li><li> 수술 도구 : SuperCut 이리스 가위, 스트레이트 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), Vannas 마이크로 가위, 직진 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 더몬트 포셉 (좋은 팁, 45 ° 벤트 팁, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 바이폴라 응고 장치 (고주파 건조기 900 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 마이크로 선박 클립 (세계 정밀 계측기, 주식, 사라소타, 플로리다, 미국) </li><li> 외과 용품 : 무균 커튼 팁, 잎사귀, 압박 붕대 스펀지, 봉합사 (7-0 실크 봉합사, Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국), 조직 접착제 (Vetbond, 3M 회사, 세인트 폴, 미네소타, 미국); 외과 스크럽 : Bethadine, 70 % 에탄올 및 멸균 식염수 0.9 %, 아이 연고 (Puralube 베트 연고, Pharmaderm, 멜빌, NY, 미국). </li><li> MCAO을위한 폐색 봉합 준비 : <ol><li> MCA 폐색을위한 필라멘트 : 7-0 외과 나일론 monofilament의 봉합 (Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국). </li><li> 봉합사 팁 (열 소작 단위, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다)을 둔화에 대한 열원. </li><li> 액체 실리콘 고무 (실리콘 RTV 접착제, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국). </li></ol></li><li> 현미경을 분석 해 봅시다 / 외과 (Leica 스테레오 현미경 MZ6). <ol><li> 광섬유 조명기 (광섬유 조명기 FO1 - 150, TechniQuip 공사, 리버 모어, CA, 미국). </li></ol></li><li> 레이저 도플러 flowmetry (PeriFlux 시스템 5000, Perimed, 스톡홀름, 스웨덴). <ol><li> 유연한 microtip (MT B500 - 0 스트레이트 Microtip, Perimed, 스톡홀름, 스웨덴) </li></ol></li><li> 온도 매개 변수 : <ol><li> 직장 온도 모니터 (BAT - 12, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, FL). </li><li> 열전달 담요 (T / 펌프 TP600, Gaymar, NY, 미국). </li></ol></li><li> 얼룩 및 볼륨 경색의 양적 측정 : <ol><li> 2 % 솔루션 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (2 % TTC, 시그마 - 알드리치 (주), 세인트 루이스, MO, 미국). </li><li> 쥐 두뇌 행렬 슬라 이서 (Zivic - 밀러 연구실., 주식 회사, 앨리슨 공원, PA, 미국). </li><li> 디지털 카메라 (V1253, 코닥 (주), 로체스터, NY, 미국). </li><li> 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, 미국). </li></ol></li></ol> 2. 사전 외과 단계 <ol><li> 이전 수술로, 생쥐는 설치류 물과 식량을 무료로 이용할 수있는 12시 12분 어둠 / 빛이주기 밑에 위치해 있습니다. </li><li> MCAO에 대한 봉합은 그것이 (7-0 건조 수 있도록, 열 및 액체 실리콘 고무와의 팁에서 코팅 봉합 샤프트의 3-4mm로 봉합 팁의 1-2mm을 둔화에 의해 준비되며 팁 직경 0.20 - 0.25mm; 코팅 길이, 3~4밀리미터, 봉합 길이 11~13mm). 불임은 위에서 언급한 모든 단계에서 보존해야합니다. </li><li> 마우스를 무게 후 마취가 유도 챔버에서 isoflurane 4퍼센트와 유도는 30 % O 2 70% N 안면을 통해 2 O 가스 혼합물에서 isoflurane 1.5-2 %로 절차를 수행하는 동안 유지. </li><li> 마우스는 온도 제어 운영 표면 (열 담요)에 누워 거즈 패드에 발생하기 쉬운 위치에 배치되며 머리 모피는 면도 있습니다. </li><li> 윤활유 안과 연고는 양쪽 눈 모두에 적용되며, 눈꺼풀은 수술 과정 중에 안구 건조를 막기 위해 폐쇄됩니다. </li><li> 정중선 절개 (1cm)은 nasion과 피부가 부착 유연한 microtip을 (; 0.5mm 직경 MT B500 - 0 스트레이트 Microtip)에 옆으로 뽑아입니다 뛰어난 nuchal 라인에서 두개관을 overlying 피부에 이루어집니다. microtip는 레이저 도플러 flowmetry하여 MCA 영역에 혈액 흐름을 모니터 오른쪽 정수리 두개골의 표면 (후부 1mm 및 bregma에 측면 5mm)에 직각 배치됩니다. </li><li> 동물 부정사 위치로 설정되어 전에 유연한 microtip 단단히 두개골에 첨부되어 있는지 확인합니다. 동물의 목을은 부드러운 패드에 위치하고 코가 마취 장치의 코 콘에서 개최됩니다. 이것은 유연한 microtip을위한 충분한 공간이 필요하게됩니다. </li><li> 직장 온도 프로브는 ± 0.5 ° C.는 37 상수 동물 코어 온도를 유지하기 위해 삽입 </li><li> 모두 forepaws과 hindpaws는 운영 플랫폼 표면 녹화하고 있으며, 꼬리는 직장 관이 테이프로 붙여져 있습니다. </li> &lt;/ 올&gt; 3. MCA 폐색 수술 : <ol><li> 운영 현미경, 정중선 목 절개는 부드럽게 풀어 피부를 리프팅하여 manubrium와 턱 사이에 가위로 이루어집니다. </li><li> 이점 기본 턱밑 분비가 퉁명스럽게 현장에두고 왼쪽 선 (腺)으로 나누어집니다. 오른쪽 턱밑 글랜드는 cranially 철회하고 sternocleidomastoid 근육과 함께 안전합니다. </li><li> 경동맥 칼집을 포함 omohyoid 근육의 노출된 부문은 신중하게 픽업과 함께 나눌 수 있습니다. </li><li> 바로 일반적인 경동맥 (CCA)는 조심스럽게 미주 신경 및 칼집 (CCA로 측면에 위치)에서 분리하여 격리됩니다. </li><li> 향후, MCA 폐색을 수행하기 위해 자주 사용되었습니다 2 수술 방법은 분기 : </li></ol> 고이즈미의 4 방법 <ol class="lroman" type="i"><li> 세 느슨한 칼라의 봉합 (7-0 비단)은 오른쪽 CCA 주변 준비가되어 있습니다. </li><li> 외부 경동맥의 동맥 (ECA)는 식별 고립, 그리고 불로 지졌죠 (분기점에 말초 2-3mm)입니다. 이것은 이후에 마이크로 가위로 나눌 수 있습니다. 소작된 사이트에서 실수로 주변 피해를 방지하기 위해 전원은 전원 손잡이를 사용하여 1로 설정해야합니다. 이것은 모든 cauterizations에 대해 일치합니다. </li><li> 충분한 긴장은 혈액의 흐름 (영구 결합)을 막다에 CCA에서 가장 근위 칼라 봉합에 적용됩니다. 흐름 폐색은 기본 대뇌 피질의 관류 값 ~ 50 % 드롭에 의해 확인됩니다. </li><li> 그런 다음 선박 클립 arteriotomy의 시간에 역행 흐름을 피하기 위해 단지 CCA의 분기점 앞에 배치됩니다. </li><li> arteriotomy는 마이크로 가위 (가까이 내고까지)와 근위 출혈도 잡았 봉합 및 CCA의 선박 클립 사이에 수행됩니다. </li><li> 열 무딘 실리콘 코팅 7-0 나일론 봉합사는 arteriotomy를 통해 소개하고 선박 클립에 도달까지 고급입니다. 2 나머지 느슨한 칼라 봉합은 부드럽게 동맥 벽에 ...에 상처​​를 입히다하지 않는주의, CCA를 통해 흐름 누출을 다시 피하기 위해 arteriotomy 및 선박 클립 사이 CCA 주위 강화되며 다음 선박 클립이 철회됩니다. </li></ol> 롱가의 3 방식 <ol class="lalpha" type="a"><li> ECA는 식별 불로 지졌죠 (1로 설정 전력), (언어 및 상악 동맥으로의 분기점 근처) 가능한 한 해부하고, 마이크로 가위로 나뉘어져 있습니다. </li><li> 두 느슨한 칼라의 봉합 (7-0 실크)는 단지 CCA의 분기점 위의 근위 ICA 주변 준비가되어 있습니다. </li><li> CCA는 일시적으로 혈관 클립과 함께 닫힙니다. 흐름 폐색은 기본 대뇌 피질의 관류 값 ~ 50 % 드롭에 의해 확인됩니다. </li><li> 다음 ICA가 일시적으로 arteriotomy의 시간에 역행 흐름을 피하기 위해 두 느슨한 옷깃 봉합 위에 선박 클립과 함께 닫힙니다. </li><li> arteriotomy는 유세에 반영 ECA 가까이에있는 마이크로 가위를 사용하여 수행됩니다. </li><li> 열 무딘 실리콘 코팅 7-0 나일론 봉합사는 ECA에서 arteriotomy를 통해 소개하고 ICA에 적용 선박 클립에 도달까지 고급입니다. 근위 ICA에이 느슨한 칼라 봉합은 부드럽게 동맥 벽에 ...에 상처​​를 입히다 못할 정도로 관심과 ICA를 통해 환류 혈액 흐름을 피하기 위해 근위 ICA 주위 강화되며 다음 선박 클립이 철회됩니다. </li></ol> 절차의 나머지 부분은 대부분 수렴입니다 <ol><li> 가벼운 저항이 생각 때까지 occluding의 봉합은 천천히 두개골 기본 방향으로 내부 경동맥 (ICA)를 통해 고급입니다. 기준에 대한 상대적인 비율 (= 80 %)으로 대뇌 혈류의 가치에 동시 드롭은 레이저 도플러 flowmetry에 의해 확인됩니다. 2 칼라 봉합은 삽입 필라멘트 주위에 강화하고 있습니다. </li><li> 일시적 대뇌 국소 빈혈 실험은 occluding의 봉합사는 45 분 후에 부드럽게 철회합니다. 이 시점은 다양한 실험적인 목표에 대해 변경할 수 있습니다. </li><li> 봉합사 필라멘트를 철수 후, arteriotomy 사이트는 수술 후 출혈을 피하기 위해 닫힙니다. 고이즈미의 방법에서는, 이것은 안전 CCA 주위에 목걸이를 봉합을 강화 포함됩니다. 롱가의 기술에 ECA의 기지에서 arteriotomy 사이트가 불로 지졌죠는 다음 근위 ICA에서 칼라 봉합은 느슨하게하고 경동맥 흐름을 복원 제거됩니다. </li><li> 절개를 닫으려면, 턱밑 글랜드과 SCM은 수술 분야를 통해 마련하고 있습니다. 상처의 가장자리는 다음 자궁 경부에서 조직 접착제와 두피 영역 approximated 있습니다. 또는, 흡수성 봉합 또는 금속 주식은 동물의 장기적인 생존을위한 것입니다 특히 상처를 가까이하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 절개 폐쇄 후, 동물 볼륨 보충으로 subcutaneously 1 ML 따뜻한 호수를받습니다. 적절한 진통제의 투여 (0.05-0.1 MG / kg에서 즉, Buprenorphine)는 복구 기간 동안 동물의 고통과 불편을 최소화하기 위해 사용해야합니다. 애니마나는 수술 스위트룸에서 제거하고 부드러운 음식과 물을 무료로 쉽게 접근할 수있는, 저체온증을 방지하기 위해 따뜻한 복구 지역 / 케이지에 있습니다. </li></ol> 4. 수술 신경학 평가 동물이 전체 의식을 차릴 후 3 다음과 같이 신경 결손은 간단한 스케일 (5 점 척도)에 의해 평가할 수있다 : <ol start="0"><li> 눈에 띄는 적자 없음 </li><li> contralateral 앞발 (온화한 초점 neurologic 적자)를 확장 실패 </li><li> 경색에 contralateral 방향으로 공전하는 (중간 초점 neurologic 적자) </li><li> 경색에 contralateral 방향으로 떨어지는 (심각한 초점 neurologic 적자) </li><li> 자발적인 움직임없이 의식의 우울 수준 </li></ol> 5. 얼룩 및 뇌 경색 볼륨의 양적 측정 <ol><li> MCA의 reperfusion 24 시간 후, 남은 마우스는 4 % isoflorane와 깊이 anesthetized 무게이며, 승인된 프로토콜에 따라 희생. </li><li> 두뇌는 신중하게 제거하고 마우스 뇌 매트릭스 기계에 배치하고, 전체의 꿈은 2mm 간격으로 coronally sectioned입니다. </li><li> 섹션은 TTC는 인산염의 37 호수 (PBS)를 버퍼 2% ° 20 분 C로 포장되어 있습니다. TTC의 얼룩 후, infracted 지역은 붉은 벽돌 (가능한) 조직 (그림 1)에 인접한 흰색 (흠없는) 조직으로 표시됩니다. </li><li> 시리얼 섹션은 이미지 J 프로그램 측정 디지털 카메라 경색의 면적을 사용하여 촬영하고 있습니다. </li><li> 경색의 영역 (흰색, 흠없는), ipsilateral 반구 (스테인드, 벽돌 흰색과 빨간색) 분야, 그리고 contralateral 반구 (붉은 벽돌, 스테인드)의 영역은 각 섹션에 대한 측정입니다. 볼륨은 모든 섹션에서 대표적인 영역을 합산하여 슬라이스의 두께로 곱하여 계산합니다. 부종에 대한 보정 후, 경색의 볼륨은 다음과 9과 같이 계산됩니다 : 수정된 경색 볼륨 (문학), % = [contralateral 반구 볼륨 - (ipsilateral 반구 볼륨 - 볼륨 경색)] / contralateral 반구 볼륨 X 100 </li></ol> 6. 대표 결과 대뇌 국소 빈혈 과도를 확립하기 위해 왼쪽 CCA를 통해 폐색 및 MCA의 reperfusion 후, 동물 희생하고 자신의 coronally sectioned 두뇌는 경색의 볼륨 (그림 1)을 평가하는 TTC 물들일 수 있습니다. <img src="files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 생쥐에서 TTC - 묻은 시리얼 코로나 두뇌 섹션 (2mm)는 MCA 폐색를 받게. </ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
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</ol>

저자들은 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.

MCAO 모델은 murine 종의 대뇌 국소 빈혈을 복제 설립 모델입니다. 이 모델은 처음 쥐에 사용하고 이후 마우스에 적응했다. 혈액 뇌 장벽의 투자율과 intracranial 압력에 대한 수술 조작의 영향을 제거하는 craniectomy을 방지하는 것이이 기술의 장점입니다. 그러나, 이러한 스트레인과 관련된 차이가 10, 폐색 6, 체온 12, 마취 13 봉합 팁 11 기간의 크기 및 기타 요인에 많은 변수를이 모델에서 경색 볼륨에 불일치가 발생할 수 있습니다. 언급을 보증 구체적인 기술적인 세부 사항이 있습니다 : <ol><li> 코팅 봉합사의 끝 감소 천공의 위험이있는 MCA를 occluding위한 부드럽고 관리 치료를 생성합니다. </li><li> 인접한 동맥에서 미주 신경 정말 그것은 실수로 칼라 봉합에 있으니까 별도로 안전하게 제한되지 않습니다. occluding의 봉합을 오름차순 동안 arteri...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 남성 C57BL / 6 마​​우스 </td><td> 동물 </td><td> 할런 연구소, 인디애나 폴리스, IN, 미국 </td><td></td><td> 20-26 GRS </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 현미경 </td><td> Leica 스테레오 현미경 MZ6 </td><td></td><td> 6.3:1 줌 </td></tr><tr><td> 광섬유 조명기 </td><td> 조명기 </td><td> TechniQuip 주식, 리버 모어, CA, 미국 </td><td></td><td> FO1 - 150 </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 마취 </td><td> 백스터 조제학, 디어 필드, IL </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> 직선 SuperCut 이리스 가위, </td><td> 수술 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 14,218 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas 마이크로 가위, 직선 </td><td> 수술 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 14,003 </td><td></td></tr><tr><td> 더몬트 좋은 팁 포셉 </td><td> 수술 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 503290 </td><td></td></tr><tr><td> 선박 클립 </td><td> 수술 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 14,120 </td><td></td></tr><tr><td> 고주파 건조기 900 </td><td> 수술 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 500397 </td><td></td></tr><tr><td> 7-0 외과 나일론 monofilament의 봉합 </td><td> 봉합하다 </td><td> Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국 </td><td> 1647G </td><td> 폐색에 대한 봉합 </td></tr><tr><td> 7-0 외과 실크 봉합 </td><td> 봉합하다 </td><td> Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국 </td><td> 7733G </td><td> 결합에 대한 봉합 </td></tr><tr><td> 실리콘 RTV 접착제 </td><td> 실리콘 고무 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 1571 </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 조직 접착제 </td><td> 3M 회사, 세인트 폴, 미네소타, 미국 </td><td> 70200746587 </td><td></td></tr><tr><td> Puralube 베트 연고 </td><td> 아이 연고 </td><td> Pharmaderm, 멜빌, NY, 미국 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine hydrochlorode </td><td> 진통제 </td><td> Hospira 주식 회사, 레이크 포레스트, IL, 미국 </td><td> NDC 0409-2012-32 </td><td></td></tr><tr><td> 열 소작 단위 </td><td></td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> 501292 </td><td></td></tr><tr><td> PeriFlux 시스템 5000 </td><td> TCD flowmetry </td><td> Perimed, 스톡홀름, 스위든 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BAT - 12 </td><td> 직장 온도계 </td><td> 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 </td><td> BAT - 12R </td><td></td></tr><tr><td> T / 펌프, TP600 </td><td> 열 담요 </td><td> Gaymar, NY, 미국 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 알드리치 (주), 세인트 루이스, MO, 미국 </td><td> T8877 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 뇌 매트릭스 슬라 이서 </td><td> 브레인 슬라 이서 </td><td> Zivic - 밀러 연구실., 주식 회사, 앨리슨 공원, PA, 미국 </td><td> BSMAS001 - 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 레이저 도플러 flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 intraluminal 폐색 (mcao) 모델

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

스트로크 2009 1,2 년 미국에서 근처 70,000,000,000달러의 예상 비용, 죽음의 세 번째 주요 원인과 세계에서 장애의 주요 원인이다. intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델 쥐에 impactful 인간의 병리 현상을 시뮬레이션하기 위해 1986 년 고이즈미 사에 의해 개발되었습니다. MCAO 방식의 수정은 나중에 롱가 3 수여되었다. 두 기술은 널리 허혈성 뇌졸중 및 잠재적인 치료 modalities 5로 인한 뇌 손상의 분자 메커니즘을 식별하는 데 사용되었습니다. 쥐이 비교적 비침 투 방법은 유전자 변형과 녹아웃의 변종 6,7을 활용하는 마우스에 사용하도록 확장되었습니다. 모델 초점 대뇌 국소 빈혈하려면, intraluminal 봉합은 MCA의 기반을 막다하기 위해 내부 경동맥을 통해 고급입니다. 지정된 기간 후에 Retracting 봉합사는 자연 reperfusion을 모방한 것이었지만, 봉합도 영구적으로 유지하실 수 있습니다. 이 동영상은 stepwise 방식의 생쥐에 intraluminal MCAO 절차를 수행하기위한 두 가지 주요 접근 방식을 보여주는,뿐만 아니라 잠재적인 단점과 함정에 대한 통찰력을 제공합니다. 허혈성 뇌 조직은 이후 대뇌 경색 8 정도를 평가하는 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)로 물들일 것이다.

intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델은 실험 허혈성 뇌졸중 모델 중 가장 자주 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 전체 레이저 도플러 flowmetry의 가이드와 함께 상세하게 모델 및 대표 결과를 보여줄 것입니다.

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

뇌졸중은 전 세계적으로 세 번째로 높은 사망 원인이자 가장 주요한 장애 원인이며, 미국 내에서만 약 700억 달러의 비용이 발생하는 것으로 추산됩니다.

본 비디오 논문에서는 중대뇌동맥 폐쇄(middle cerebral artery occlusion, MCAO)로 알려진 허혈성 뇌졸중 동물 모델을 제시합니다. 코일(coil)을 이용한 기존의 MCA 폐쇄 방법에서는 뭉툭한 봉합사를 총경동맥을 통해 삽입하여 중대뇌동맥을 폐쇄합니다. 이 방법은 총경동맥의 영구적인 폐쇄를 초래합니다.Longa에 의한 방법론적 수정은 외경동맥을 통해 중대뇌동맥에 접근할 수 있게 합니다. 이 방법은 실험적 허혈성 뇌졸중 모델들 중에서 총경동맥의 기능과 그 원위부 순환을 보존합니다. 쥐와 생쥐에서의 혈관 내 필라멘트 중대뇌동맥 폐쇄 모델은 쥐에서 처음 기술된 이후 가장 빈번하게 사용되는 모델 중 하나이며, 초기 모델에 대한 여러 수정 사항이 발표되었습니다. 현재 Longa 수정법이 가장 두드러진 변형 모델입니다.이 모델은 침습성이 낮으며, 제어된 방식으로 영구적 및 일시적 허혈을 유도하기 용이합니다. 관강 내 필라멘트를 이용한 중대뇌동맥 폐쇄 모델은 단일 필라멘트를 내경동맥에 삽입하여 중대뇌동맥으로 가는 혈류가 차단될 때까지 전진시키는 방식입니다. 이 모델은 재현 가능한 중대뇌동맥 영역의 경색을 유발하며, 봉합사를 제거한 후 재관류가 가능합니다.이 기술에서 경색의 크기는 봉합사의 직경, 봉합사의 실리콘 또는 폴리올 라이신 코팅 여부, 필라멘트 자체의 삽입 길이와 같은 많은 특정 요인에 의해 영향을 받는 것으로 보입니다. 이 영상에서는 이 모델을 단계별로 수행하는 방법과 더불어, 이 방법을 사용할 때 발생할 수 있는 여러 잠재적 오류와 단점을 피하는 방법을 보여드리겠습니다. MCA 폐색을 위해 7.0 모노필라멘트 나일론 봉합사를 사용하겠습니다.나일론 봉합사의 끝부분을 열원 근처에 가져가 뭉툭하게 만들어야 합니다. 뭉툭해진 끝부분은 곧고 매끄러워야 하며, 길이는 약 1~2 mm가 되어야 합니다. 끝부분을 뭉툭하게 만든 후, 봉합사의 전체 길이를 약 11~13 mm가 되도록 잘라야 합니다.봉합사의 뭉툭한 끝부분을 실리콘에 담가 끝에서 3~4mm 정도가 코팅되도록 한 후 건조시킵니다. 봉합사 준비의 모든 단계는 무균 상태에서 수행되어야 합니다. 마우스의 무게를 측정한 후, 유도 챔버에서 4% isof fluorine을 사용하여 마취를 유도합니다.마우스를 가열 패드 위에 놓인 거즈 패드 위에 복와위로 눕힙니다. 심부 체온을 37°C로 유지하기 위해, 시술 중에 안면 마스크로 마취 상태를 유지합니다. 제모한 머리 부위를 알코올, 베타딘 순으로 닦아낸 후 다시 알코올로 세척합니다.bgma에서 후방으로 1 mm, 외측으로 5 mm 떨어진 부위의 두개골을 노출시키기 위해 피부에 1 cm 절개를 가합니다. 혈류량을 모니터링하기 위해 유연한 마이크로 팁을 우측 두정골 표면에 수직으로 부착합니다. 레이저 도플러 혈류 영상 장치를 사용하여 MCA 영역을 측정합니다.동물을 다시 배와 위를 향한 자세(supine position)로 놓은 후, 가슴뼈자루(manubrium)와 턱 사이의 목 중앙선을 가위로 절개합니다. 쌍으로 존재하는 턱밑샘을 둔하게 분리하여 그 아래의 구조물인 이복근, 흉쇄유돌근, 그리고 기관을 노출시킵니다. 이 구조물들을 견인하여 삼각형 모양으로 벌리고 추가로 박리하면 총경동맥, 미주신경, 내경정맥이 나타나며, 그 앞쪽에서 총경동맥이 외경동맥과 내경동맥으로 분지됩니다.후두동맥은 분지 지점에서 기시하는 모습으로도 관찰될 수 있습니다. COE의 방법에서는 근위부 총경동맥을 미주신경으로부터 조심스럽게 분리하고 격리합니다. 총경동맥 주위에 세 개의 느슨한 칼라 봉합사를 준비합니다.미주신경이 봉합사에 끼이지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다. 외경동맥을 확인하고 분리합니다. 그 후 분지점에서 원위부로 2~3mm 지점을 소작합니다.혈류를 영구적으로 차단하기 위해 총경동맥의 가장 근위부 칼라 봉합사를 조입니다. 기저 피질 관류 값에서 약 50%의 감소가 나타나는 것으로 혈류 차단을 확인합니다. 봉합사의 여분 끝부분을 잘라냅니다. 역행성 혈류를 방지하기 위해 총경동맥 분기점 바로 앞에 혈관 클립을 배치합니다.다음으로, 미세 가위를 사용하여 혈관 클립과 결찰사 사이를 절개합니다. 이를 통해 끝이 뭉툭한 가열 봉합사를 총경동맥 내로 삽입하고 혈관 클립에 도달할 때까지 전진시킬 수 있습니다. 남은 두 개의 느슨한 칼라 봉합사를 조심스럽게 조여 총경동맥을 통한 역류 누출을 방지합니다.혈관 클립을 제거하고 뭉툭한 봉합사를 내경동맥 내부로 조심스럽게 진입시킵니다. 도플러 판독값에서 기준치 대비 약 80%의 감소가 나타나며 가벼운 저항이 느껴질 때까지 진행합니다. 역행성 출혈을 방지하기 위해 두 개의 칼라 봉합사를 단단히 조입니다.이제 마우스를 적절한 시간 동안 허혈 상태로 둡니다. 재관류를 모사하기 위해, 적절한 간격을 두고 폐쇄 봉합사를 제거합니다. 도플러 측정값이 급격히 상승하면 측부 혈류가 회복되었음을 나타냅니다.봉합사를 완전히 빼내고, 두 개의 칼라 봉합사를 완전히 조인 뒤 롱 메소드(long method)로 다듬습니다. 중대뇌동맥을 폐쇄하기 위해 다른 경로를 사용할 수 있습니다. 먼저, 외경동맥을 확인하고 분리한 후, 봉합사 삽입을 위한 충분한 길이를 남겨두고 가능한 한 말단 부위를 소작합니다.그 후 외경동맥을 절단하고 그 분지들 또한 소작 후 절단합니다. 외경동맥의 단면은 견인하여 고정합니다. 총경동맥 분지점 바로 위의 근위부 내경동맥 주변에 두 개의 느슨한 칼라 봉합사를 준비합니다.총경동맥을 혈관 클립으로 일시적으로 차단합니다. 이로 인해 분기점 바로 원위부의 관류 수치가 약 50% 감소합니다. 내경동맥 역시 혈관 클립으로 동일하게 클램핑하며, 마이크로 가위를 사용하여 견인된 외경동맥 단단 끝부분 근처에 동맥 절개술을 시행합니다.열처리를 통해 끝을 뭉툭하게 만든 봉합사를 동맥 및 외경동맥을 통해 삽입하여 내경동맥의 혈관 클립에 도달할 때까지 진입시킵니다. 근위 내경동맥 주변의 느슨한 칼라 봉합사 두 개를 혈류의 역류를 방지할 수 있도록 조심스럽게 조이되, 동맥벽에 손상을 줄 정도로 과하게 조이지 않도록 합니다. 그런 다음 내경동맥에서 혈관 클립을 제거하면, 삼구개동맥이 내경동맥에서 분지됩니다.봉합사를 조심스럽게 진입시킬 때, 내부로 다시 유입되지 않도록 주의해야 합니다. 도플러 판독 장치에서 두 번째 강하가 관찰됩니다. 뭉툭한 봉합사가 중간뇌동맥에 도달하면, 역행성 출혈을 방지하기 위해 칼라 봉합사를 다시 조여야 합니다.이제 마우스를 적절한 시간 동안 허혈 상태로 유지합니다. 뭉툭한 봉합사를 제거하여 혈류를 복원하면 Doppler 모니터의 수치가 상승하는 것을 확인할 수 있습니다. 봉합사를 완전히 제거한 후, 외경동맥의 절단단을 소작합니다.수술 후 출혈을 방지하기 위해 총경동맥의 개통성을 유지하도록 주의해야 합니다. 그다음 근위부 내경동맥의 칼라 봉합사를 헐겁게 하여 절단하고, 총경동맥의 클립을 제거하여 혈류를 복원합니다. 이는 도플러 측정값의 두 번째 도약으로 나타납니다.마우스가 의식을 회복하면, 5점 척도에 따라 여러 시점에서 신경학적 결손을 평가할 수 있습니다. 0점은 관찰 가능한 신경학적 결손이 없음을 나타내며, 경증 뇌졸중과 일치하는 1점은 뇌졸중 발생 반대 측의 전지(forepaw)를 뻗지 못하는 것으로 확인됩니다. 중등도 뇌졸중과 일치하는 2점은 뇌졸중 발생 반대 방향으로 원을 그리며 도는 행동으로 확인됩니다.중증 뇌졸중(stroke)에 해당하는 3점의 점수는 뇌졸중 발생 반대 방향으로 쓰러지는 것으로 확인됩니다. 4점의 점수를 가진 마우스는 자발적인 운동 활동을 보이지 않습니다. 뇌졸중 부피를 측정하기 위해, 적절한 시점에 두개골에서 뇌를 적출합니다.재관류 후, 뇌를 매트릭스 슬라이서(matrix slicer)에 넣고 전체 대뇌를 관상면으로 절단합니다. 2mm 간격으로 절단하며, 소뇌와 후각구는 제거합니다. 각 2mm 절편을 2% TTC 용액에 담그고 37°C의 암소에서 20분 동안 반응시킵니다.뇌 절편의 디지털 이미지를 보면 TTC가 살아있는 조직은 붉게 염색하고, 경색된 조직은 각 절편에서 창백한 흰색으로 남긴 것을 알 수 있습니다. 여기서 1로 표시된 부분은 경색 부위입니다. 여기서 2로 표시된 전체 동측 반구의 면적과 3으로 표시된 대측 반구의 면적을 모두 Image J 프로그램으로 측정하였으며, 모든 절편의 면적을 측정한 후 각 면적 값의 합계에 절편 두께를 곱하여 전체 부피를 계산할 수 있습니다.부종을 보정한 경색 부피를 구하기 위해 다음 공식을 사용합니다. 이 부피는 동측 대뇌 반구 부피에 대한 백분율로 표시됩니다. MCO 모델은 재현 가능한 결과를 제공합니다.하지만 몇 가지 절차적 요인이 기술의 수행을 방해할 수 있습니다. 봉합사 끝부분의 실리콘 코팅은 봉합사 표면을 매끄럽게 하여 내피 마모나 혈관 천공의 위험을 낮추기 때문에 중요합니다. 또한, 봉합사 코팅은 서로 다른 실험 목적을 반영하여 수정될 수 있습니다.팁에서 3~4mm 이상 코팅하면 중대뇌동맥 근위부 동맥이 폐쇄되어 전체 뇌졸중 부피가 증가하게 됩니다. 미주신경을 압박하지 않도록 색실을 주의해서 사용해야 하며, AAL 벽에 외상이 생기지 않도록 부드럽게 묶어주어야 합니다. 마우스의 체온은 경색 범위에 영향을 줄 수 있으므로, 시술 전 과정 동안 체온을 일정하게 유지해야 합니다.이 비디오가 수술 과정의 이해를 돕고 귀하의 실험을 위한 견고한 시작점이 되기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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중간 대뇌 동맥의 폐색 Filamentous은 생쥐에서 허혈성 뇌졸중 공부를위한 일반적인 모델입니다.

마우스의 모델링 스트로크 - 필라멘트 모델 중간 대뇌 동맥 폐색

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

쥐 intraluminal 중간 뇌성 가림 모델은 여기서 제공됩니다. 대뇌 경색의 범위는 neurologic 점수와 cresyl 보라색의 착색, TTC의 대안 얼룩, 병렬 많은 관심 마커에서 테스트 큰 이점을 제공함으로써 평가됩니다.

Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

대뇌 국소 빈혈의 여러 동물 모델은 스트로크의 인간의 조건을 시뮬레이션하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 쥐의 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 (동부 표준시-1) 유발 중간 뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델에 대해 설명합니다. 또한 중요한 고려 사항, 장점,이 모델의 단점은 설명되어 있습니다.

쥐의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 유도 중간 뇌 동맥 폐색 모델

중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)의 다양한 쥐 모델은 널리 실험 뇌 연구에 사용됩니다. 여기서 우리는 인간의 허혈성 뇌졸중의 대다수에 의해 부과 된 손상에 해당하는 크기의 일관성있는 대뇌 피질의 경색을 생산 두개 영구 원심 MCAO의 모델을 보여줍니다.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

뇌졸중의 병태 생리를 이해하기 위해, 신뢰할 수있는 모델을 사용하는 것이 중요하다. 마우스에서 가장 자주 사용되는 뇌졸중 모델 중 하나를 설명한다 본 논문의 중간대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델이라 재관류 (또한 관내 또는 필라멘트 봉합사 모델 지칭).

마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 스트로크에 대한 수술 적 접근

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 외부 경동맥을 통한 일시적인 중간 뇌동맥 폐색

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.

뇌졸중의 일시적인 중뇌동맥 폐색 모델

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

학습하세요 마우스 MCAO 모델을 이용한 허혈성 뇌졸중 연구 방법과 레이저 도플러 혈류측정 기술을. 이 기법은 뇌졸중 메커니즘 연구와 치료 개발에 필수적인 도구입니다.

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

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