Name: 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 고분자량 DNA 추출 방법을 미생물 매트에서 세포 분리 및 동결-융해 기법을 활용하여. 이 프로토콜은 기능적 메타게놈 연구를 위한 고품질 DNA 확보에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 환경 게놈 프로그램 (그랜트 번호 EF - 0723707)에 의해 재정 지원되었다.

1. 미생물 세포 추출 : <ol><li> 철저하게 혼합하여 멸균 분쇄 유봉과 미생물 매트를 균질. 약 워링 믹서기의 멸균 용기에 무균 매트 재료의 모든 30g (서부 유럽 표준시 무게), 1 분 1 M NaCl (또는 사용 예제 특정 농도) 100 ML에 대한 추가하고, 중간 속도로 세 번 조화를 배치 1 분 -20 ° C의 냉동고에 간헐적으로 냉각. 250 ML의 원심 분리기 병에 슬러리를 전송하고 1 M NaCl과 함께 남아있는 빈 볼륨을 작성하십시오. autoclaved DI 워터의 NaCl 용액을 준비하고 소독 필터. </li><li> 또한 30 분 실온에서 vortexer (소용돌이 - 지니 R 2)를 사용하여 (150 RPM) 흔들림으로 모체의 미생물 세포를 이동시키다. </li><li> 4 15 분 ° C. 낮은 속도 (500x g)에서 원심 분리기 부드럽게 퇴적물에 최소한의 방해와 플라스크에 뜨는를 전송합니다. </li><li> pelleted 퇴적물을 사용하면, 단계 1.3의 끝 부분에 각각의 퇴적물 펠렛 신선한 NaCl의 추가와 함께 1.2 1.3 4 개의 추가 시간을 혼합하여 단계를 반복합니다. 각 NaCl 추출에서 뜨는은 신선한 플라스크로 전송됩니다. </li><li> 4 15 분에 대한 고속 (25,000 XG) 200 ML의 aliquots에 5 세포 extractions 및 원심 분리기에서 supernatants을 결합 ° C. 뜨는을 취소, 2 % 나트륨 hexametaphosphate 10 ML 각 세포 펠렛을 resuspend, 알약을 결합하고 2 % 나트륨 hexametaphosphate 200 ML에 볼륨을합니다. 30 분 상온에서 (150 RPM)에 의해 세포를 흔들어 씻으십시오. 이 단계의 끝에서 당신은 다음 단계로 진행하는 세포 중 하나만 튜브가 있어야합니다. </li><li> 4 15 분 ° C.에 대한 고속 (25,000 XG)에서 원심 분리기 TE (50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 200 ML에 뜨는, resuspend 세포 펠렛을 무시, 10 분 상온에서 (150 RPM)에 의해 세포를 흔들어 씻는다. </li><li> 4 15 분에 대한 고속 (25,000 XG)에서 원심 분리기 ° C가, 15 ML TE (10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 resuspend 뜨는을 폐기하고, -80에서 보관 200 μL aliquots ° C까지 DNA extractions 필요. </li></ol> 2. DNA 추출 및 정제 : <ol><li> 200 μL 5 M NaCl, 200 μL 10% SDS와 200 μL 미생물 세포 나누어지는 100 μL 14.3 M의 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. 반전 4-6 배 부드럽게 섞는다. </li><li> 5 분 65 ° C 물 욕조에서 해동 다음 2 분에 대한 액화 질소에 잠수함이 잠수하여 동결 - 해동의 3 라운드에 따라 혼합물. 최종 10 분에 해동 연장. </li><li> 200 μL 5 M의 칼륨 아세테이트 (산도 5.5) 10 분 얼음에 장소를 추가합니다. 4 10 분 10,000 XG에 원심 분리기 ° C와 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 1 시간을 위해 RNase 37과 부화는 ° C의 3 μL를 추가합니다. </li><li> 클로로포름의 동일한 음량을 추가, 역전에 의해 잠시 흔들하고, 실온에서 10 분 15,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 신중하게 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 뜨는의 상단에 레이어를 전송합니다. 상단 및 하단 레이어 사이에있는 흰색 인터페이스 레이어를 pipetting하지 마십시오. 클로로포름 - 추출 절차를 반복합니다. </li><li> 냉장의 동일한 음량 (-20에서 ° C) 촉진의 DNA로 30 분 얼음에 뜨는와 부화 이소프로판올. 추가 </li><li> 4 10 분 최대 속도 (20,800 XG)에서 원심 분리기 ° C 펠렛 DNA 있습니다. </li><li> 냉장 1 ML 70 % 에탄올 (-20 ° C에서)로 뜨는 및 세척 DNA 펠렛 폐기하십시오. </li><li> 4 10 분 최대 속도 (20,800 XG) ° C에서 원심은, 표면에 뜨는를 버리고 10 분 70 %의 에탄올 세척 및 공기 건조 DNA 펠렛를 반복합니다. 70 % 에탄올 세척을 반복합니다. </li><li> 25 μL TE (10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 Resuspend의 DNA, 65 ° 따뜻한 5 분 C는 여러 개의 튜브가 사용되었습니다면 한 튜브에 결합하고, TE 500 μL에 볼륨을 구성합니다. </li><li> 추가 500 μL 얼음처럼 차가운 (또는 4 ° C) 20 %의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (1.2 M NaCl에서 준비). 펠렛 DNA 4 10 분 최대 속도로 10 분, 그리고 원심 분리기를위한 얼음에 품어 역전, ° C에 의해 부드럽게 섞는다. 제거하고 폐기 뜨는하고 냉장 70 % ethanol, 10 분 대한 항공 건기 1 mL로 pelleted DNA를 씻고, 그리고 30-50 μL TE or 분자 학년 물에 resuspend. 65 온난화에 의한 DNA의 resuspension을 촉진 ° -80시 5 분 및 저장 DNA에 대한 C ° C. </li></ol> 3. DNA 순도, 농도 및 크기 결정 : <ol><li> 280분의 260과 Nanodrop 1000 분광 광도계 또는 다른 적절한 장비를 사용하여 230분의 260 비율을 측정하여 DNA의 품질을 확인합니다. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 퀀트 - IT dsDNA 분석 키트를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. </li><li> 펄스 필드 겔 전기 영동을 사용하여 DNA의 크기를 결정합니다. 0.5X TBE와 1퍼센트 아가로 오스 겔을 준비하고 다음 주방장 매퍼 XA 시스템에 대한 매개 변수를 사용; 0.35 s의 초기 스위치 시간, 7.67 s의 마지막 스위치 시간, 120 °는 다음 위치에서 6.0 V / cm의 그라데이션에 대한 각도를 포함 리니어 R요소를 좋아지고. 30 분 1 X SYBR 그린 I와 젤 얼룩. 겔에 700-1000 NG 총 DNA 사이에로드합니다. 그림을 참조하십시오. 전체 프로토콜의 응축 형태 3. </li></ol> 대표 결과 : 세포 추출 : 순차 미생물 세포 추출물은 (supernatants) 추출물의 탁도가 extractions 증가의 숫자로 감소하는 것으로 나타났습니다. 이것은 각각의 연속된 세포 추출 다음과 같은 세포의 수를 감소를 제안합니다. 여기서주의해야할 중요 각 추가 셀 추출 단계는 오염 물질 도입에 대한 기회를 제공으로, 휴대 extractions의 번호가 최종 세포 펠렛은 전체 미생물 커뮤니티의 대표되도록 최소화해야한다는 것입니다. 오염의 다른 소스는 적절한 실험실 멸균 기술을 채택하여 제어했습니다. 예를 들어, 솔루션은 autoclaved DI 물의 준비와 필터를 소독했다. 컨테이너는 알코올로 소독 autoclaved하고, 자외선과 자외선 crosslinker에 따라 치료를했다. DNA 농도 및 품질 결정 : 프로토콜은 1.6 280분의 260 비율로 매트 샘플 g 당 HMW DNA (35-50킬로바이트) (그림 4)의 약 2 μg을 굴복하고, 0.7의 230분의 260 비율 (표 1). 230분의 260 비율이 같은 rRNA 유전자는 별도의 연구 7 관찰했던 16의 PCR - 증폭 등 하류 분자 기반 응용 프로그램에 대한 억제 낮은하지 나타나지만. EPS와 소금, hypersaline 매트에서 해당 DNA 오염의 두 가지 주요 출처가에 유의하는 것이 중요합니다. 그것은 이러한 오염 물질의 흔적은 다운 스트림 애플 리케이션에 미치는 영향을 줄이기 위해 엄청난 노력에도 불구하고 230분의 260 비율에 영향을 미치는있을 수 있으므로 가능합니다. DNA 크기 결정 : 펄스 필드 겔 전기 영동은 그림 3과 같이 DNA의 얼룩의 발생 간헐적인 방향 스위치와 pulsating 전류 흐름을 사용합니다. 우리 프로토콜은 약 35-50킬로바이트의 H​​MW DNA를 나왔고. 일부 DNA 크기가 30킬로바이트보다 작아야 수 있지만, 그것은 fosmid 복제가 ~ 40킬로바이트 DNA 삽입이 필요하며 큰 DNA 조각은 그대로 biosynthetic 경로에 큰 액세스를 제공하는 주어진 35킬로바이트 위의 얼룩의 일부를 가지고하는 것이 중요합니다. 우리의 연구에, 35킬로바이트 위의 DNA의 얼룩은 excised되었으며 대형 삽입 벡터 클로닝 및 기타 분자 애플 리케이션을위한 정화. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 엘류테라, 바하마에있는 그림 1. Hypersaline의 미생물 매트 샘플링 사이트 (빅 폰드). <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 본 연구에서 사용되는 hypersaline 미생물 매트의 단면. 미생물 매트는 엘류테라, 바하마에있는 hypersaline 연못로부터 얻은 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 미생물의 세포 추출, 세포 용해, 추출, metagenomic DNA의 정화에 참여 절차 도식 표현은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 펄스 필드 겔 전기 영동을 사용하여 추출한 DNA의 분자량 특성화. 레인 M은 HMW 마커이며, 골목길 1과 2는 위의 프로토콜을 사용 엘류테라 hypersaline 매트에서 추출한 DNA의 복제 metagenomic 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 추출 방법 </td><td></td><td> 농도 NG / G </td><td> 280분의 260 </td><td> 230분의 260 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> 담당자 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> 담당자 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> 표 1. DNA의 농도 및 품질 측정은 미생물의 hypersaline 매트에서 추출한.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

복잡하고 매우 다양한 미생물 매트 샘플에서 전체 세포 제거 실용적 아니라는 것을 감안할 때, 기본 우려가 추출된 세포가 전체 미생물 매트 커뮤니티를 대표하는 얼마나 잘됩니다. 이전 연구에서는 미생물의 유전자 16 rRNA의 PCR - DGGE 분석이 프로토콜에 사용되는 다섯 셀 제거 단계를 전체 미생물 매트 커뮤니티 7 대표하는 세포를 추출 것으로 나타났다. 세포 추출의 실제 번호는 전체 미생물 커뮤니티의 대표적인 가능성이 샘플 종류에 의존 변화하는 세포 펠렛을 제공하는 데 필요한 단계를 반복합니다. 다른 샘플에 대한 최적의 프로토콜 개발을위한, 작은 규모의 파일럿 연구는 각 세포 추출 단계는 원래 지역 사회의 풍요로움에 비해 후 복구 미생물의 풍요로움의 경험적 테스트를 궁극적 권장합니다. Fosmid 복제는 복제 라이브러리 건설 8 35-40킬로바이트의 HWM DNA가 필요합니다. 우리 프로토콜 35-50킬로바이트 (그림 4)에 이르기...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 1.2 M NaCl에 최고 20 % </td></tr><tr><td> 칼륨 아세테이트 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td></td><td> 피셔 사이 언티픽 </td></tr><tr><td> 퀀트 - IT dsDNA 분석 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> BDH 화학 </td><td> BDH8014 </td><td> 적절한 CONC. </td></tr><tr><td> 나트륨 Dodecyl의 황산 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 03-500-509 </td><td> 물에서 10 % </td></tr><tr><td> 나트륨 hexametaphosphate </td><td> EMD 화학 </td><td> SX0583 - 3 </td><td> 물에 2% </td></tr><tr><td> TBE </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP1333 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 요리사 매퍼 XA 시스템 </td><td> 바이오 래드 연구소 </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 분광 광도계 </td><td> 써모 과학 </td><td> ND - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> 과학 산업 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자외선 Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 워링 믹서기 </td><td> 워링 실험실 </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

미생물 매트에서 높은 분자량의 dna의 추출

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

metagenomic 데이터의 성공적인 정확한 분석과 해석은 고품질, 높은 분자량 (HMW) 커뮤니티 DNA의 추출 효율에 의존적일 수 밖에 없습니다. 그러나, 환경 매트 샘플은 종종 높은 품질 HMW DNA의 큰 농도를 구하기 위해 어려움을 제기. Hypersaline의 미생물 매트 높은 세포외 고분자 물질의 양의 (EPS) 1 추출한 DNA의 다운 스트림 애플 리케이션을 억제 수 염분이 포함되어 있습니다. 직접적이고 거친 방법은 자주 내화물 샘플에서 DNA 추출에 사용됩니다. 매트, 접착제 매트릭스에 EPS 직접 용해하는 동안 DNA 2,3를 바인딩하기 때문에 이러한 방법은 일반적으로 사용됩니다. 엄격한 추출 방법의 결과로, DNA되고 작은 크기 4,5,6으로 조각. DNA 따라서 대형 삽입 벡터 복제에 대한 부적 절한됩니다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 우리는 hypersaline 미생물 매트에서 좋은 품질과 수량의 HMW DNA를 추출하는 개선된 방법을보고합니다. 우리는 혼합 및 차동 원심 분리를 통해 배경 매트 매트릭스에서 미생물 세포의 분리와 관련된 간접적인 방법을 고용. 기계적 및 화학적 절차 조합이 추출된 미생물 세포에서 DNA를 추출하고 정화하는 데 사용되었다. 우리 프로토콜 1.6 280분의 260의 비율로, 매트 샘플 g 당 HMW DNA (35~50킬로바이트)의 약 2 μg을 산출. 또한, 16 rRNA 유전자 7 증폭이 프로토콜은 오염 물질의 억제 효과를 최소화하거나 제거할 수 있다고 제안합니다. 우리의 결과는 기능 metagenomic 연구 미생물 매트에서 HMW의 DNA의 추출을위한 적절한 방법을 제공하고 DNA 추출이 어려운있는에서 다른 환경 시료에 적용할 수 있습니다.

우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

메타게놈 데이터의 성공적이고 정확한 분석 및 해석은 고품질의 고분자량 ...의 효율적인 추출에 달려 있습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 고염분 미생물 매트에서 고분자량 DNA를 추출하는 것입니다. 이는 먼저 미생물 매트에서 미생물 세포를 균질화하고 추출함으로써 수행됩니다. 그 후, 동결-해동 및 화학적 방법을 사용하여 미생물 세포를 용해합니다.다음은 유기 용매 추출을 통해 세포 잔해와 RNA를 제거하고, 이어서 DNA를 추출하는 과정입니다. 절차의 마지막 단계는 DNA 침전 및 정제입니다. 최종적으로 고분자량의 품질과 고농도의 DNA 결과를 얻을 수 있습니다.직접적이고 가혹한 DNA 추출법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 복잡한 환경 시료로부터 고분자량 DNA를 사용하여 기능적 메타게놈 연구를 수행할 수 있다는 점입니다. 본 연구에 사용된 미생물 매트는 바하마 엘루테라에 위치한 초염수 연못에서 수집되었습니다. 배경 매트 매트릭스에서 미생물 세포를 추출하기 위해, 먼저 약 30 g의 매트를 멸균된 분쇄 페스틀을 사용하여 갈지 않고 충분히 섞어줍니다. 혼합물에서 덩어리가 보이지 않을 때 매트가 완전히 균질화된 것입니다.다음으로 균질화된 매트(matte) 재료를 블렌더에 넣고 약 100 milliliters의 염화나트륨을 첨가합니다. 중간 속도로 1분 동안 혼합한 후, 영하 20 °C에서 1분 동안 냉각합니다. 이 혼합 및 냉각 과정을 두 번 더 반복합니다. 혼합이 완료되면 슬러리를 250 milliliter 원심분리 병에 옮기고, 나머지 빈 공간을 1 molar 염화나트륨으로 채웁니다.실온에서 30분 동안 흔들어 섞어준 후, 슬러리를 4°C에서 15분 동안 저속 원심분리합니다. 그다음 침전물이 최대한 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 플라스크로 조심스럽게 옮깁니다. 펠릿 형태의 침전물에 신선한 염화나트륨을 첨가합니다.다시 혼합하고 30분 동안 흔들어 줍니다. 그런 다음 이전과 동일하게 원심분리하고, 상층액을 새 플라스크로 옮깁니다. 신선한 염화나트륨 첨가, 혼합, 원심분리 및 상층액 제거 과정을 세 번 더 반복합니다.5회의 세포 추출물 상층액을 합치고, 200 mL의 분주액을 4°C에서 15분 동안 고속 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 각 세포 펠릿을 10 mL의 sodium hexametaphosphate에 재현탁합니다. 4개 튜브의 세포 현탁액을 모두 합친 후, sodium hexametaphosphate를 추가하여 최종 부피를 200 mL로 맞춥니다.실온에서 30분 동안 흔들어 세포를 세척합니다. 흔든 후 4°C에서 15분 동안 고속 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음 세포 펠렛을 200 mL의 세척액에 재부유시켜 다시 실온에서 10분 동안 흔들어 세척합니다. 마지막으로 4°C에서 15분 동안 다시 고속 원심분리합니다.snat Resus를 버린 후, 세포 펠릿을 15 milliliters의 te에 현탁하여 200 microliter의 미생물 세포 분주액을 준비합니다. 미생물 세포는 DNA 추출이 필요할 때까지 minus 80 degrees Celsius에서 보관할 수 있습니다. 미생물 세포로부터 DNA를 추출하고 정제하는 과정을 시작하려면, 각 200 microliter의 미생물 세포에 sodium chloride SDS와 beamr capto ethanol을 첨가합니다.총 8개의 튜브에 분주합니다. 4~6회 부드럽게 뒤집어 섞은 후, 혼합물을 액체 질소에 2분 동안 담근 다음 65 °C에서 5분 동안 해동합니다. 액체 질소 침지 및 65 °C 해동 과정을 2회 더 반복합니다.최종 해동 시간을 10분으로 연장합니다. 세 번째 동결-해동 주기가 끝난 후, 각 튜브에 200 µL의 potassium acetate를 첨가하고 10분 동안 얼음 위에 둡니다. 그 다음 4 °C에서 10,000 g로 10분 동안 원심분리합니다.다음으로, 광구 피펫 팁을 사용하여 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 3 µL의 RNAs A를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간의 배양 후, 동일한 부피의 클로로포름을 첨가합니다.역전시켜 짧게 흔든 후 15,000 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 추출 과정을 반복합니다.다시 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 상층액에 동일한 부피의 냉각된 isopropanol을 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. DNA를 침전시키기 위해 최대 속도로 원심분리하여 DNA 펠릿을 형성하고, 상층액을 제거한 후 각 DNA 펠릿을 1 mL의 냉각된 70% ethanol로 세척합니다.70% ethanol 세척 과정을 반복하고, 4°C에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 70% ethanol 세척을 반복하고 DNA 펠렛을 10분 동안 공기 건조합니다.각 DNA 펠렛을 약 25 µL의 te에 재현탁합니다. 65 °C에서 5분 동안 가온한 후, 모든 샘플을 하나의 튜브에 합치고 te를 사용하여 최종 부피를 500 µL로 맞춥니다. 폴리에틸렌 글리콜을 넣고 부드럽게 뒤집어 섞은 후, 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.DNA를 침전시키기 위해 원심분리합니다. 그다음 차가운 70% ethanol로 DNA를 세척한 후 상층액을 제거하여 버립니다. 10분 동안 공기 건조한 뒤, 30~50 µL의 TE 또는 molecular grade water에 재현탁하고 65 °C에서 5분 동안 가온합니다.DNA를 -80 °C에서 보관하십시오. 이 표는 미생물 초염분 매트에서 추출한 DNA의 농도 및 품질 측정 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜을 통해 매트 샘플 1 g당 약 2 µg의 DNA를 얻었으며, A₂₆₀/A₂₈₀ 비율은 1.6, A₂₆₀/A₂₃₀ 비율은 0.7이었습니다.A260/A280 비율이 낮게 나타났음에도 불구하고, 펄스장 겔 전기영동(pulse field gel electrophoresis)을 사용하여 DNA 크기를 측정한 별도의 연구에서는 16S ribosomal RNA 유전자의 PCR 증폭과 같은 하위 분자 기반 응용 분석에서 억제 현상이 관찰되지 않았습니다. 결과는 약 35~50 kb의 고분자량 또는 HMW-DNA를 나타냅니다. 여기서 레인 M은 HMW 마커이며, 레인 1과 2는 Eleuthra 초염수 매트(hyper saline mat)에서 추출한 메타게놈 DNA의 반복 시료입니다. 35 kb 이상의 DNA smear 부분을 절단 및 정제하여 대용량 삽입 벡터 클로닝이나 다른 적절한 분자 생물학적 응용 분석에 사용할 수 있습니다.이 절차를 마친 후, 조사 대상인 미생물 군집의 기능적 다양성은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 P-C-R-D-G-G-E 클로닝 또는 DNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)

이 글에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용한 규조류 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다.

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

이 프로토콜은 단단하고 마이콜산이 풍부한 세포벽이 제기하는 도전을 극복하여 마이코박테리아로부터 고품질 DNA를 추출하는 CTAB 방법을 설명합니다. 이 과정은 효소 소화, CTAB를 이용한 세포 용해, 유기 추출과 에탄올 침전을 통한 DNA 정제를 포함합니다. 이 방법은 분자 연구에 적합한 DNA를 생성하며, 균세균 연구에 신뢰할 수 있습니다.

세틸트리메틸암모늄 브로마이드 기법을 이용한 마이코박테리아 종에서 전체 게놈 디옥시리보핵산 추출

미생물 커뮤니티의 생물학 - 인터뷰

학습하세요 고분자량 DNA 추출 방법을 미생물 매트에서 세포 분리 및 동결-융해 기법을 활용하여. 이 프로토콜은 기능적 메타게놈 연구를 위한 고품질 DNA 확보에 필수적입니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

더 많은 동영상 탐색