스프 레딩 우울증을 사용하여 에피소드와 만성 두통의 신경 면역 신호를 모델링 체외에서

이 비디오의 목표는 편두통 전조와 편두통의 가장 가능성이 높은 근본 원인인 우울증 확산에 대한 감수성을 조절하는 신경 면역 신호를 해독하기 위해 해마 절편 배양을 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 확산되는 우울증은 해마 절편 문화에서 쉽게 유발됩니다. 배양액은 몇 주 동안 in vitro에서 유지되기 때문에 개별 세포 유형의 거동을 장기간에 걸쳐 측정, 모방 및 조절할 수 있습니다.

이는 신경 면역 신호 연구에 특히 중요합니다. 성숙한 해마의 뇌 절편은 정지된 면역 상태를 달성하기 때문에, 현대 분자 생물학 기술을 사용하여 마취의 잠재적인 교란 효과 없이 우울증이 확산되는 면역 반응을 평가할 수 있습니다. 슬라이스에서 최소 50개의 세포에서 약 90, 000개의 세포에 이르는 사이토카인 신호의 민감한 검출을 그에 따라 결정할 수 있습니다.

해마 뇌 절편 배양은 편두통을 완화하기 위한 새로운 신경 면역 치료제 개발에 사용하기에 이상적입니다. 제 이름은 이안 버그(Yian Berg)이고, 시카고 대학 메디컬 센터(University of Chicago Medical Center)의 신경과 리처드 크레이그(Richard Craig) 실험실에서 근무하는 아야 푸스(Aya Puss)와 하이디 미첼(Heidi Mitchell)입니다. 오늘 우리는 쥐 해마, 이, 배양 및 우울증 확산의 낮은 수준의 면역 신호에 대한 연구를 시연할 것입니다.

확산 우울증은 발작성 신경 사건으로, 증가된 시냅스 활동의 폭발에 의해 촉발된 다음 곧 모든 활동의 일시적인 손실이 뒤따릅니다. 낮은 수준의 면역 신호가 뇌 내의 시냅스 활동에 영향을 미칠 수 있고 그 대가로 영향을 받을 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 우리는 사이토카인이 우울증이 퍼지는 것에 대한 감수성을 조절하고, 그 결과 편두통과 편두통을 유발할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

여기에서 설명하는 절차는 잠재적으로 혼란을 일으킬 수 있는 면역 세포 활성화를 최소화하고 낮은 수준의 면역 신호를 감지하는 능력을 향상시키도록 설계되었습니다. 이를 통해 가장 광범위한 신경 면역 신호와 우울증 확산과의 상호 작용을 감지할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 유리관을 4.5mm 길이로 절단하여 접지 전극을 만드십시오.

그런 다음 양쪽 끝의 절단 부분을 짧게 화염 연마합니다. 다음으로, 100ml의 염화몰 칼륨을 끓이고 한천 3.5g과 EDTA 0.5g을 추가합니다. 혼합물을 계속 저어주어 맑은 노란색 용액을 만듭니다.

각 유리관 위에 짧고 유연한 튜브 조각을 끼웁니다. 그런 다음 따뜻한 염화칼륨 농업 용액을 유리관에 넣고 유연한 튜브에 짧은 거리를 끌어들입니다. 흡입을 해제하고 염화칼륨 한천이 유리관의 열린 끝에서 천천히 떨어지도록 합니다.

한천이 뚝뚝 떨어지면 열린 유리관의 끝으로 얼음 조각을 만지면 한천이 유리관 튜브로 물러난 후 겔이 아닌 전극 끝에서 겔화됩니다. 한천이 젤링되면 아그라의 위치를 변경하지 않고 유연한 튜브를 부드럽게 제거합니다. 유리관에 0.5ml의 염화몰 1.5ml를 1.5ml 원심분리기 튜브 랙의 각 웰에 넣습니다.

그런 다음 각 염화칼륨 afil 유리관의 끝을 개별 웰에 넣어 팁을 촉촉하게 유지합니다. 다음으로, 지혈기로 80cm 길이의 15 게이지 은선을 잡습니다. 조리대에 고정된 에머리 보드를 통해 와이어를 긁어 네 면 각각을 청소합니다.

그런 다음 와이어를 4cm 길이로 자릅니다. 표백제를 채운 섬광 바이알에 20-30분 동안 넣습니다. 청소된 은색 표면 위에 단단한 은색에서 은색 염화물 코팅을 놓으려면 와이어를 반으로 구부리고 염화칼륨 한천으로 채워진 유리관에 삽입하여 약 4-6mm를 노출시킵니다.

그런 다음 은선이 들어있는 유리관 끝과 와이어의 일부를 염화칼륨 한천이 건조되는 것을 방지하기 위해 방수 및 유연한 접착제 인 끈적 끈적한 접착제로 코팅하고 모든 전극에 대해 반복하고 접착제를 밤새 건조시킵니다. 드로잉 후 전극을 5ml의 1몰 염화칼륨과 25mg의 EDTA가 함유된 섬광 바이알에 보관합니다. 섭씨 4도에서 바이알당 약 5-6개의 전극.

필라멘트가 있는 규산보 유리관으로 전극을 기록합니다. 다음으로, 약 20cm 길이의 테프론으로 코팅된 백금 자오선을 절단하여 자극 전극을 만듭니다. 그런 다음 길이를 반으로 구부리고 느슨한 끝을 느슨한 사각형 매듭으로 묶고 매듭에서 와이어 끝까지 약 2cm를 남겨 둡니다.

지혈기로 와이어의 다른 쪽 끝을 잡고 테이블 위에 놓인 전기 캔 드릴의 척에 매듭을 고정합니다. 와이어가 단단히 꼬일 때까지 드릴을 짧게 켜고 끕니다. 백금 자오선 연선을 리드선에 연결하려면 먼저 백금 자오선 연선을 벤치 탑에 테이프로 붙이고 꼬인 전선의 한쪽 끝에 농축 염산 웅덩이를 떨어뜨립니다.

그런 다음 벗겨진 끝을 꼬인 와이어 끝에 인접한 리드선에 놓고 가는 팁 납땜 인두에서 열을 가한 다음 두 와이어가 단단히 연결될 때까지 납땜합니다. 노출된 전선 연결부 위로 짧은 길이의 열 수축 튜브를 밀어 넣고 열 불로 수축시킵니다. 15cm 길이의 파이펫 끝을 연마하고 꼬인 백금 자오선 와이어를 파이펫 아래로 안내합니다.

발수 에폭시를 사용하여 전극의 양쪽 끝을 밀봉하십시오. 마지막으로, 입체 관찰 하에 자극 절연체에 연결하기 위해 리드선 끝에 바나나 플러그를 부착합니다. 전극 팁을 PBS에 놓고 꼬인 전선의 측면에서 기포가 나오는 경우 전극 팁의 절단된 끝에서만 나오는 전해 생성 기포를 찾습니다.

단일 모서리 면도날을 사용하여 전극을 가로로 절단하여 전선의 긴 축에 온전한 절연을 다시 설정합니다. 애버런트 자극 효과를 해결하기 위해 문제를 해결할 때 새로 절단된 전극 팁을 만들어 보십시오. 또 다른 중요한 단계는 슬라이스 배양 인서트와 약 1.0cm 간격으로 배치된 두 개의 1.0 x 12mm 유리 막대 위에 놓인 35mm 배양 접시로 구성된 기록 접시를 준비하는 것입니다.

유리 막대는 유리관을 가열한 다음 집게로 바닥으로 눌러 접시 바닥에 부착됩니다. 정적 기록 조건의 경우 접시에 1.5ml의 미디어를 추가합니다. 그런 다음 너비 10mm, 길이 3-4cm의 멸균 솜 조각을 담그십시오.

1.0 밀리리터의 미디어에서 장축을 따라 코튼을 반으로 접고 인서트의 내벽을 따라 놓습니다. 멸균 집게로 젖은 면은 접시 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 압축 가능한 4mm 길이의 튜브 조각 3개가 인서트 주위에 동일한 간격으로 배치되어 있습니다.

가스 교환을 허용하기 위해 접시를 폴리염화비닐 필름으로 단단히 덮으십시오. 그런 다음 단일 모서리 면도날로 중간 수직 벽 주위를 잘라 과도한 폴리염화비닐을 제거합니다. 필름은 0.2 헤르츠에서 100 마이크로 초 펄스로 3 개의 필드 전위를 유발하며, 응답을 트리거하기에 충분한 약 1-5 마이크로 암페어의 전류로 시작합니다.

자기장 전위가 최대가 될 때까지 파라메탈 뉴런 장축을 따라 기록 전극을 점진적으로 움직입니다. 다음으로, 이 위치에서 기록 전극으로 전류를 증가시키고 약 10-20 마이크로 암페어의 최대 전류 응답에 유의하십시오. 마지막으로, 트랜스 시냅스 유발 확산 우울증의 역치를 결정하기 위한 실험에 최대 자극 강도의 절반을 사용합니다.

자극 패러다임을 전환하여 10Hz에서 펄스당 100마이크로초의 단일 버스트를 수동으로 불러올 수 있습니다. 확산 우울증이 유발될 때까지 자극 버스트당 현재 강도를 점진적으로 증가시킵니다. 럼에서 우울증 역치가 확산되면 한 시간 동안 9분마다 우울증이 퍼지는 것으로 보고되었습니다.

별도의 디지털 신호 처리 시스템을 통해 3개 영역의 빠른 전위 및 느린 전위 변화를 기록합니다. 마지막으로 퍼지는 함몰 후 배양 인서트를 정상적인 배양 상태로 되돌리고 배양 접시 뚜껑을 표시합니다. 우울증이 확산되는 것을 경험한 문화는 배양 수확까지 3-4일마다 미디어를 바꾼다.

성장 배지에서 ISO selectin을 밀리리터당 20마이크로그램으로 희석하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 이미징 4-10시간 전에 정상적인 배양 조건에서 절편 배양을 배양하고, 이미징 최소 1시간 전에 현미경 카메라를 켜고, 자외선 온도 제어 및 가스를 주입합니다. 다음으로, 바닥에 두 개의 1mm 유리 막대가 있는 35mm 배양 접시에 삽입물을 배치한 후 이미징을 위한 변형 소프트웨어를 설정합니다.

그런 다음 인서트의 벽과 배양 접시 사이에 2mm 길이의 고무 튜브 3개를 끼웁니다. 인서트를 더욱 안정화하려면 인서트 내부에 10mm 너비의 면 조각을 추가로 1mL의 미디어에 담궈 넣습니다. 가습 환경을 유지하려면 배양 접시 상단을 폴리염화비닐 필름으로 단단히 덮으십시오.

체액 손실을 방지하려면 이미징의 초점이 CA 3개의 파라메탈 세포층에 있는지 확인하십시오. 미세 초점 창에서 5 x 10 x 및 20 x로 위상 사진을 촬영하여 슬라이스 방향을 확인하고 현재 범위를 8로 설정하고 정확도를 한 번의 클릭으로 초점을 찾아 획득 타임랩스 창에서 초점이 맞는 이미지를 확인합니다. 시간 간격을 1분으로, 지속 시간을 6시간으로 선택하여 미세아교세포의 움직임을 정확하게 포착합니다.

이미징은 영화가 끝날 때 분당 한 번 이상 자주 이루어져야 합니다. PCR 실험을 위한 CY talk 스크리닝을 통해 세포 손상 여부를 확인합니다. 나중에 슬라이스 배양액을 2-3밀리리터의 RNA에 삽입하고 추가 처리 전까지 최대 3일 동안 섭씨 4도에서 보관합니다.

수확하려면 유리 칼을 사용하여 외부 조직을 제거하고 조각을 개별 RNA에 넣습니다. 0.5 밀리리터의 멸균 인산염 완충 식염수를 함유한 DNA 무함유 1.5 밀리리터 원심분리 튜브. 정밀한 tipped paintbrush 회전급강하 표본을 사용하여, 모든 조각이 그들의 관의 동일한 측에 고착한다 그래야 고정관념적인 방식으로 1 분 동안 10, 000 회전수.

PBS 상등액을 제거하고 500마이크로리터의 트리올에 샘플을 재현탁합니다. 시료를 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 RNA 추출이 가능할 때까지 얼음에 보관하십시오.SI RNA 녹다운으로 인한 단백질 발현 변화는 은 강화 및 후속 밀도 측정 정량화를 통해 기존의 DAB 면역 염색을 강화하여 민감하게 평가할 수 있습니다. 여기에 도시된 것은 CA 3개의 파라메탈 뉴런층에 기록 마이크로 전극을 배치하고 치상회에 바이폴라 자극 전극을 배치하는 슬라이스 배양 전기생리학적 기록 패러다

다음은 치상회(dentate gyrus) 자극에 의해 유발된 CA 3장 전위의 예이며, 이는 절반 최대 반응을 확립하는 데 사용되며, 이는 결국 확산 우울증을 유발하기 위해 강도가 점진적으로 증가한 왼쪽 10헤르츠 버스트에 대한 CA 3장 전위 반응을 보여줍니다. 오른쪽 아래에 있습니다. 여기에 보이는 것은 모범적인 필수 면역 세포입니다.

이 이미징은 미세아교세포의 일부가 시냅스 활동에 반비례하는 밧줄 비행으로 알려진 빨간색으로 표시된 최적의 검색 패턴으로 장거리를 이동한다는 것을 처음으로 보여줍니다. CDNA의 Preem 증폭을 통해 해마 절편 배양에서 IFN 감마를 검출할 수 있습니다. 처음에 참조 유전자 RPL 13 A의 CT는 20.5였고 왼쪽에서 IFN 감마는 검출되지 않았습니다.

그러나 오른쪽에 표시된 Preem 증폭 후 IFN 감마는 29.0에서 쉽게 검출되었습니다. RPL 13 A가 14.1에서 등록되어 신호 증폭의 12배 증가를 나타내면 면역조직화학적으로 효율이 확인됩니다. peroxidase diamine benzine immuno staining의 차별화된 은 강화는 siRNA 처리된 해마 절편 배양물에서 cyclophilin B 생산의 현저한 감소를 정량화하는 데 사용됩니다.

이 비디오에 설명된 기술은 며칠에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 우리는 우리의 해마 절편 배양이 생체 내 배양과 매우 유사하며 면역 신호를 연구하고 우울증을 퍼뜨리는 데 이상적이라는 점을 강조하고 싶습니다. 그러나 통제되고 가짜 상태인 상태에서 정지 면역 환경을 유지하는 것이 필수적입니다.

면역 활성화를 최소화하려면 배양물을 무균 상태로 유지해야 합니다. 과도한 화학적, 기계적 또는 열 섭동에 노출되어서는 안 됩니다. 생리학적 사이토카인 신호전달은 펨토 어금니 수준에서 발생하기 때문에 매우 민감하고 재현성 있는 측정 기술을 적용해야 합니다.

당사는 PCRA 기술과 민감한 단백질체 기술을 사용합니다. 마지막으로, 사이토카인은 다발성(pleiotropic)이며 중복성(redundant)입니다. 그러므로. 시간이 지남에 따라 측정된 다중 사이토카인 표적은 면역 신호가 염좌, 우울증 및 더 나아가 편두통에 대한 감수성을 어떻게 조절하는지 연구하는 데 유용합니다.