높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 PCR로 생성된 템플릿으로부터 digoxigenin으로 표지된 리보 프로브(ribo probe)를 합성함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 진동 마이크로톰(vibrating microtome)을 사용하여 두껍게 절단된 섹션을 제작하는 것입니다.

세 번째 단계는 맞춤형 바스켓에 담긴 하부 비뇨생식기 경로 절편에서 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하는 것입니다. 결합된 리보 프로브(ribo probe)를 BM purple 침전 알칼리성 인산분해효소 기질을 이용하여 면역조직화학적으로 검출함으로써 mRNA를 시각화합니다. 최종적으로, 현미경 관찰을 통해 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 경로 내에서 저발현 및 고발현 mRNA 전사체의 공간적, 시간적 국소화를 확인할 수 있습니다.

면역조직화학법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 ribo probe를 생성하기 쉽고 마우스 전체 게놈의 대부분의 mRNA를 인식하도록 만들 수 있다는 점입니다. 이 방법은 태아 마우스의 생식 비뇨기 발달 과정 중 mRNA 발현 패턴에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 장기 시스템, 종 및 발달 단계에도 적용될 수 있습니다. 조직을 agar에 매몰시키는 과정은 습득하기 어려울 수 있으며, 방향의 미세한 차이가 일관되지 않은 결과로 이어질 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 조직을 준비하기 최소 하루 전에 지름 12 millimeter의 milli cell culture plate에서 막을 제거하여 버리십시오. 이때 남은 링은 몰드 역할을 하게 되며, 이 링들을 RNase 억제제 용액에 담가 하룻밤 동안 적셔 둡니다.

프로토콜 수행 당일에, 단계별 메탄올로 재수화된 마우스 하부 비뇨생식기를 해부합니다. PBS tween으로 세척하면서 방광의 약 2/3를 제거하고, 남은 하부 비뇨생식기 조직을 PBS tween에 보관합니다. 이제 처리된 링 몰드를 유리 현미경 슬라이드 위에 배치하고, 62 °C의 4% 저융점 아가로스 용액을 채운 후 약 2분 동안 식힙니다.

이제 하부 요로 조직의 물기를 완전히 제거한 후 agarose 용액에 담급니다. 핀셋을 사용하여 조직이 링의 상단과 하단 중간에 위치하도록 방향을 조정합니다. agarose가 굳을 때까지 4 °C에서 배양기에 넣어 보관합니다.

조직을 절편화하기 전, 용매와 물로 헹구어 맞춤형 wilkinson blade를 준비합니다. 이중 날을 길이 방향으로 나누어 두 개의 단일 날로 분리합니다. 그다음, 마이크로톰 날을 사용하여 Wilkinson blade를 지지합니다.

이를 위해 먼저, 마이크로톰 칼날을 윌킨슨(Wilkinson) 칼날의 길이에 맞게 자릅니다. 그런 다음 Lock Tite 접착제를 사용하여 마이크로톰 칼날을 윌킨슨 칼날의 절단면에서 약 3~4mm 떨어진 위치에 접착합니다. 이제 보강된 칼날을 진동 마이크로톰에 장착하고 칼날 각도를 35도로 설정합니다.

욕조에 PBS를 채우고 주변을 젖은 얼음으로 채워 디럭스 시편 욕조(deluxe specimen bath)를 준비합니다. 플러그에 임베딩된 조직을 장착하기 전에, 링 몰드에서 조직을 꺼내 바닥 표면을 블록 건조시킵니다. 그런 다음 Loctite 접착제를 사용하여 건조된 표면을 마운팅 디스크에 접착합니다.

디스크를 진동 절편기(vibrator)에 삽입하고, 절편 두께를 50 microns로, 속도를 2로, 칼날 진폭을 4로 조정합니다. 조직 절편을 자르는 동안, 둔단 핀셋을 사용하여 각 절편을 0.5 mL의 ice cold PBS tween이 채워진 24-well 배양 플레이트로 옮깁니다. 절단 후, IN situ hybridization을 시작하기 전에 스프링 가위로 각 조직 절편 주변의 aros 대부분을 제거합니다. 절편은 2 mM sodium azide가 포함된 PBS tween 내에서 4 °C로 최대 48시간 동안 보관할 수 있습니다.

먼저, 마이크로 원심분리 튜브의 바닥 부분을 100 µL 표시선에서 잘라내어 맞춤형 샘플 바스켓을 제작합니다. 튜브의 절단 부위를 불꽃으로 가열하여 플라스틱이 부드러워질 때까지 기다립니다. 그런 다음, 부드러워진 플라스틱을 메쉬 사각형 위에 단단히 누릅니다.

굳을 때까지 기다린 후 남은 메쉬를 잘라냅니다. 가열된 18 gauge 바늘을 사용하여 각 튜브 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫어 바스켓을 완성합니다. 24 well 플레이트의 뚜껑에 12 millimeter 구멍 24개를 일정한 간격으로 뚫어 샘플 바스켓을 담을 트레이를 제작합니다.

각 구멍이 웰 바로 위에 위치하도록 배치한 후, 수돗물을 0.5인치 높이로 채운 덮개가 있는 하이브리다이제이션 챔버를 60.5°C로 예열하기 시작하십시오. 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 2mL의 PBS tween을 첨가하여 인 시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 시작하십시오. 바스켓이 장착된 준비된 덮개로 이 플레이트를 덮으십시오.

이제 조직 절편을 상온에서 바스켓으로 옮긴 후, PBS tween이 포함된 6% hydrogen peroxide에서 쉐이킹 인큐베이션을 수행합니다. 이어서 PBS tween으로 여러 번 세척하고, proteinase K로 인큐베이션한 후, 다시 고정 과정을 거쳐 추가 세척을 진행합니다. 샘플 준비를 마무리하기 위해, 각 웰에 2 mL의 가온된 pre-hybridization buffer를 넣고 가열된 하이브리다이제이션 챔버 내에서 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다. 각 웰에 0.5 µg의 labeled RIBA Probe를 첨가하여 하이브리다이제이션을 시작합니다.

그런 다음, 가열된 하이브리디제이션 챔버 내부에서 하룻밤 동안 배양을 계속합니다. 다음 날, 용액 1에서 용액 2로 점진적으로 교체하며 조직을 세척한 후, RNAse로 처리합니다. 이어서 용액 3으로 세척하고, TBS tween과 조직 블로킹 버퍼로 세척한 뒤 조직 블로킹 버퍼 내에서 조직을 배양합니다.

배양 기간이 종료되면 anti dig 항체를 항체 흡수 버퍼에 넣고 4°C에서 최소 2시간 동안 배양하십시오. 항체 용액을 10,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 불용성 성분을 제거하기 위해 항체 용액 버퍼 2 mL에 Senna를 추가하십시오.

이제 블로킹 버퍼에서 조직을 꺼내 준비된 항체 용액에 넣어 배양합니다. 실험 3일 차에 하이브리드화 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 조직을 TBST로 여러 번 세척합니다.

그다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 1 mL의 NTM buffer로 조직을 10분 동안 세척합니다.

그런 다음 용액을 lava sole MBM purple이 포함된 TMT로 교체합니다. 튜브를 암소에 보관하고, 이후 며칠 동안 색 발현 상태를 모니터링하며 필요에 따라 용액을 교체합니다. 색이 완전히 발현되면 조직을 lava sole이 포함된 TMT로 짧게 세척한 다음, paraformaldehyde가 포함된 PBS에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 조직을 표백하고 세척합니다. 이제 절편을 영상화할 준비가 되었습니다. 하부 생식기계 조직은 요도 정중선이 aros 플러그의 평평한 표면과 평행하도록 아가에 임베딩되었습니다.

이러한 방향 설정으로 시상면 절편을 얻었습니다. 특수 제작된 샘플 바스켓은 먼지와 입자성 물질로부터 섬세한 조직 절편을 보호했습니다. 이는 수일에 걸친 C two 하이브리디제이션 과정 중에 수행되었습니다.

또한 모든 절편의 손실을 방지했습니다. 저발현 mRNA를 검출하는 데 필요한 장시간의 배양 과정 동안 배경 염색을 제한하는 것은 까다로운 일입니다. 하지만 sodium azide를 첨가하고 이후 여과 과정을 거침으로써 배경 염색이 제한된 것으로 보입니다.

또한, 시료를 발색 용액에 장시간 배양했을 때 배경 염색에서 눈에 띄는 차이가 나타나지 않았습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 6일 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 면역조직화학염색과 같은 다른 방법을 수행하여 mRNA의 발현 패턴이 단백질의 발현 패턴과 상관관계가 있는지 확인할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 mRNA 발현 패턴과 발달 중인 생쥐 하부 생식관을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.