Name: 높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 태아 마우스 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 고처리량 현장에서 하이브리드화 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 조직 바구니 준비에 기술 지원을위한 닥터 란 이순신, 뉴저지의 암 연구소, 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 DK083425 및 DK070219 국립 연구소에 의해 투자되었다.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법을 사용하면 여기에 설명된, 그것은 주요 세포 유형 및 mesenchymal 패드, urothelium, 부드러운 근육, 전립선 꽃봉오리, ejaculatory 덕트 및 질을 포함하여 태아 남성과 여성의 마우스 LUTs의 조직 구획의 모든 mRNAs를 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 50μm 섹션은 조직 구조 (예 : 혈관 등) 해결하기 위해 충분한 두께가되는 장점을 가지고 있지만 일반적으로 전체 마운트 이쉬 동안 발생한 방법론 문제 프로브 트래핑을 피할 정도로 얇은 있습니다. 얼룩이 이전의 출판 연구 평가되어 어디에 모든 새로운 riboprobe은 긍정적인 제어 조직에 부과됩니다. 우리는 얼룩 패턴이 조직에있는 특정 있는지 확인합니다. 우리의 방법의 또 다른 장점은 여러 mRNAs의 패턴이 동일한 LUT 조직에서 인접 조직 섹션에 평가 될 수있다는 것이다. 또한,이 방법은 세포 특정 단백질 마커를 시각화하고 이쉬 프로토콜 스테인드 셀 형식을 식별하는 immunohistochemical 기법 결합 수 있습니다....

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 방지 Digoxigenin 항체, 팹 조각 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> 시약 차단 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM 퍼플 AP 기판, precipitating </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP1600 - 100 </td></tr><tr><td> 세포 배양 플레이트,도 24 </td><td> 코닝 </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11 - UTP </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> 양날 면도날 </td><td> 윌킨슨 소드 </td><td> 클래식 모델 </td></tr><tr><td> Eliminase RNase의 제거 </td><td> Decon 연구소 </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F5786 - 1L </td></tr><tr><td> 겔 추출 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,704 </td></tr><tr><td> H 2 O에서 글루 타 알데히드, 25 % 용액 </td><td> 시그마 </td><td> G6257 - 100ML </td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O에서 과산화수소, 30 % 용액 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP2633 - 500 </td></tr><tr><td> Levamisole </td><td> 시그마 </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 빠른 설정 인스턴트 접착제 </td><td> 헨켈 주식 회사 </td><td> 46,551 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td> Maleic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> M0375 - 500G </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브, 1.5mL </td><td> Biologix 리서치 회사 </td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> Millicell 문화 플레이트 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> 분자 분쇄 수지 </td><td> G - Biosciences </td><td> 786 - 138PR </td></tr><tr><td> 인산염의 Paraformaldehyde, 4 %의 솔루션을 살린 버퍼 </td><td> Affymetrix </td><td> 19,943 </td></tr><tr><td> 인산은 칼슘 &amp; MG없이 살린 버퍼 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> 폴리에스터 메쉬, 33 미크론, 12 &quot;X 24&quot; </td><td> 소형 부품 부동산 </td><td> CMY - 0033 - D </td></tr><tr><td> Proteinase K 용액, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195 - 5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder 열 </td><td> Qiagen </td><td> 79,654 </td></tr><tr><td> Q 솔루션 </td><td> Qiagen </td><td> DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase 저해제 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> RNEASY 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase없는 DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque 낮은 용융 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,101 </td></tr><tr><td> 양 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> S2263 - 500mL </td></tr><tr><td> Stericup 필터 유닛, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> 나트륨 azide, 입상 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S227I - 100 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP358 - 212 </td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S529 - 500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X 솔루션 </td><td> 연구 제품 국제 </td><td> S24022 - 4000.0 </td></tr><tr><td> 윗첨자 III 첫 스트랜드 합성 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA 효소 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP153 - 1 </td></tr><tr><td> 트윈 20 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> 고급 표본 욕실 마이크로톰 진동 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> 효모 tRNA </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 urogenital 트랙트의 mrna의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

낮은 urogenital 트랙트 (LUT)의 개발은 복잡한 프로세스입니다. 이 복잡 androgenic 신호와 상피 - mesenchymal 상호 작용의 1,2에 의존 태아 남성 요도에서 전립선 형성하는 동안 입증합니다. 전립선 개발을 담당하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 부적절 같은 양성 전립선 증식과 전립선 암 등 전립선 질환을 야기할 나중에 삶에 reawakened 아르 성장 메커니즘을 보여줄 수 있습니다. 개발 LUT는 해부학적인 몸의 구조도 복잡합니다. 신진 시간 전립선은 16.5 일 게시 개념 (DPC)에 시작하여 많은 세포 유형이 존재한다. Vasculature, 신경 및 평활근은 mesenchymal 기질 내에 3. 이 기질은 multilayered 상피와 주변 androgen 수용체 의존 paracrine 신호 4 태아 전립선에 상승을 제공합니다. stromal androgen의의 신분 수용체 - 응답 전립선 개발 및 이들 유전자에 대한 응답으로 전립선의 상피 ductal 형태가 완전히 이해되지하는 메커니즘에 필요한 유전자. 정확하게 세포 유형을 식별하고 그들 내의 특정 요소의 표현을 집중하는 능력은 더욱 전립선 개발을 이해하는 필수적입니다. 원위치 하이브리드화 년 (이쉬) 조직 내에서 mRNAs의 국산화에 대한 수 있습니다. 따라서이 방법은이를 통해 잠재적인 전립선 개발 규제를 elucidating, 패턴 및 신호 분자와 그 수용체의 표현의 타이밍을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 진동 마이크로톰 - 컷 섹션을 사용하여 태아 마우스 LUT의 mRNA 발현 패턴을 식별하는 높은 처리량 이쉬 기술을 설명합니다. 이 방법은 다른 이쉬 프로토콜을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. 슬라이드을 준수 얇은 섹션에 이쉬 수행하는 것이 기술적으로 어렵습니다, 모두 cryosections 및 파라핀 섹션은 종종 약한 신호 해상도로 결과를하면서 cryosections 자주 가난한 구조 품질을 가지고 있습니다. 전체 마운트 조직에 이쉬 수행하면 프로브 트래핑이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 높은 처리량 기술은 세부 조직 아키텍처를 공개 두꺼운 상처 부분을 활용합니다. 수정 microfuge 튜브는 이쉬 절차를 수행하는 동안 부분을 쉽게 처리하실 수 있습니다. 4 mRNA의 성적의 최대함으로써 비용과 효율성 극대화를 줄이고, 최대 단일 실행에서 검색된 24 mRNA의 성적을 가진 단일 17.5dpc LUT에서 심사하실 수 있습니다. 이 방법은 여러 치료 그룹 따라서 해석 데이터에 대한 모든 편견을 제거, 동일하고 하나의 단위로 처리할 수 있습니다. 대부분의 pertinently 전립선 연구원이 방법은 전립선 ductal 네트워크에 상승을 제공 태아 쥐 요도의 낮은 높은 어번던스 mRNA의 성적의 공간과 시간적 위치를 제공합니다.

여기, 우리는 효율 높은 처리량을 설명<em&gt; 현장에서</em태아 마우스 전립선 조직 섹션을 개발 mRNA의 표현의 패턴을 시각화를위한&gt; 하이브 리다이 제이션 (봐야죠) 방법입니다. 방법은 쉽게 다른 마우스 조직에서 또는 다른 종 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다.

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

하부 요로생식기(lower urogenital tract, LUT)의 발달은 매우 복잡한 과정입니다. 이러한 복잡성은 태아 남성의 ...로부터 전립선이 형성되는 과정에서 입증됩니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 PCR로 생성된 템플릿으로부터 digoxigenin으로 표지된 리보 프로브(ribo probe)를 합성함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 진동 마이크로톰(vibrating microtome)을 사용하여 두껍게 절단된 섹션을 제작하는 것입니다.세 번째 단계는 맞춤형 바스켓에 담긴 하부 비뇨생식기 경로 절편에서 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하는 것입니다. 결합된 리보 프로브(ribo probe)를 BM purple 침전 알칼리성 인산분해효소 기질을 이용하여 면역조직화학적으로 검출함으로써 mRNA를 시각화합니다. 최종적으로, 현미경 관찰을 통해 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 경로 내에서 저발현 및 고발현 mRNA 전사체의 공간적, 시간적 국소화를 확인할 수 있습니다.면역조직화학법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 ribo probe를 생성하기 쉽고 마우스 전체 게놈의 대부분의 mRNA를 인식하도록 만들 수 있다는 점입니다. 이 방법은 태아 마우스의 생식 비뇨기 발달 과정 중 mRNA 발현 패턴에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 장기 시스템, 종 및 발달 단계에도 적용될 수 있습니다. 조직을 agar에 매몰시키는 과정은 습득하기 어려울 수 있으며, 방향의 미세한 차이가 일관되지 않은 결과로 이어질 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 조직을 준비하기 최소 하루 전에 지름 12 millimeter의 milli cell culture plate에서 막을 제거하여 버리십시오. 이때 남은 링은 몰드 역할을 하게 되며, 이 링들을 RNase 억제제 용액에 담가 하룻밤 동안 적셔 둡니다.프로토콜 수행 당일에, 단계별 메탄올로 재수화된 마우스 하부 비뇨생식기를 해부합니다. PBS tween으로 세척하면서 방광의 약 2/3를 제거하고, 남은 하부 비뇨생식기 조직을 PBS tween에 보관합니다. 이제 처리된 링 몰드를 유리 현미경 슬라이드 위에 배치하고, 62 °C의 4% 저융점 아가로스 용액을 채운 후 약 2분 동안 식힙니다.이제 하부 요로 조직의 물기를 완전히 제거한 후 agarose 용액에 담급니다. 핀셋을 사용하여 조직이 링의 상단과 하단 중간에 위치하도록 방향을 조정합니다. agarose가 굳을 때까지

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

심장 개발에 영향을 미치는 유전자 변경을 공부할 때 태아 및 perinatal 죽음은 일반적인 기능입니다. 고주파 초음파 이미징은 2-D 해상도를 개선하고 조기 심장 개발에 우수한 정보를 제공 할 수 있으며 죽기 전에 심장 구조와 기능에 미치는 영향을 감지 할 수있는 이상적인 방법입니다.

손쥐 태아 Echocardiography

매우 높은 주파수의 초음파는 작은 동물의 심장 이상을 검사 할 수있는 강력한 라이브 이미징 도구입니다. 그 noninvasiveness는 태아의 생리 학적 상태를 유지 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동수를 측정하는 M-모드 초음파의 사용을 보여줍니다.

비 침습 M-모드 초음파 심장 검진 법에 의한 마우스의 심장 박동의 자궁 측정

마우스 널리 임신 생물학을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 임신 종료는 이러한 연구는 경도 조사 하는 걸로 하 고 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로 필요 합니다. 따라서 조기 발견에 대 한 높은 주파수 초음파의 비-침략 적 기법 및 임신 마우스에서 후 이식 이벤트 모니터링 설명 합니다.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

배우세요 태아 마우스 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 고처리량 현장에서 하이브리드화 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법

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