체외에서 시스템

다음 실험의 전반적인 목표는 종양 휴면 또는 전이성 성장으로의 전환을 모델링하는 다음과 같은 in vitro 분석법을 사용하여, 잠재적 약물이 종양 세포의 휴면 및/또는 휴면 상태에서의 탈출에 미치는 영향을 실시간 및 고처리량 방식으로 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 플레이트 플랫폼에 맞게 조정된 3차원 배양 기저막 추출물(BME) 시스템에서 휴면 및/또는 전이성 종양 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 3D 시스템에서 배양될 때, 전이성 세포는 일시적인 휴면 또는 정지기 단계로 진입합니다.

이와 대조적으로, in vivo에서 휴면 상태인 종양 세포는 장기간의 정지 상태로 진입합니다. 3D 배양 시스템에서 전이 세포는 정지 상태에서 증식 상태로의 전환을 방지하기 위해 후보 약물로 처리될 수 있습니다. 반면, 휴면 종양 세포는 정지 상태에서 증식 상태로의 전환을 유도할 수 있는 후보 약물로 처리될 수 있습니다.

처치 결과에 따른 휴면 및 전이 세포의 증식 거동은 분석 희망 시점에 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit를 첨가한 후 ELISA 플레이트 리더로 분석하여 측정합니다. 이를 통해 3D 시스템 내 세포 증식 분석을 바탕으로 휴면 또는 전이성 종양 세포의 세포 증식에 미치는 처치 효과에 대한 결과를 얻습니다. 이 방법은 전이 분야의 핵심 질문, 즉 어떤 요인과 세포 기전이 전이성 종양 세포를 휴면 상태로 유지시키는지, 그리고 어떤 요인과 세포 기전이 종양 휴면 상태에서 임상적 전이로의 전환을 유도하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

증식 분석을 수행하기 전날, 성장 인자가 제거된 BME를 4 °C 냉장고에 넣고 하룻밤 동안 보관합니다. 그 다음 분석 당일에, 휴면성 또는 전이성 종양 세포 배양액 중 하나를 실험용으로 선택합니다. 이어서 96-웰 플레이트를 층류 후드 내 얼음 트레이 위에 놓습니다.

그런 다음 시린지가 장착된 디스펜서를 사용하여 플레이트의 각 웰에 해동된 얼음처럼 차가운 BME 50 µL를 코팅합니다. 웰에 기포가 생기지 않도록 주의하며, BME가 코팅된 96 웰 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 가습 배양기에 30분 동안 넣습니다. BME 코팅 플레이트가 배양되는 동안 trypsin 병을 37 °C에 두어 가온합니다.

종양 세포로부터 배지를 흡입하여 제거합니다. 배양 플레이트를 10 milliliters의 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 예열된 trypsin 2 milliliters를 배양 플레이트에 첨가합니다.

플레이트를 5분 동안 배양합니다. 10% FCS와 항생제가 보충된 DMEM high glucose 5 mL를 15 mL 원심분리관에 넣습니다. 이 시간 동안.

배양 후, 분리된 세포를 15 milliliter 튜브로 옮기고 세포 수를 측정합니다. 그 다음, 조직 배양용 원심분리기를 사용하여 상온에서 1500 G로 5분 동안 원심분리하여 배양할 전체 세포를 침전시킵니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

대부분의 경우 펠릿이 보이지 않으므로 배지를 약간 남겨둡니다. 그런 다음 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 단일 세포 현탁액이 되도록 합니다. 다음으로, 2 × 10³개의 세포당 100 µL의 분석 배지를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

단일 세포 현탁액 상태가 유지되도록 5 mL 피펫으로 세포를 여러 번 트리투레이션(triturate)합니다. 대조군 배경값 측정용 96-웰 BME 코팅 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL씩 분주합니다. 96-웰 BME 코팅 플레이트의 일부 웰에는 분석 배지만을 웰당 100 µL씩 추가로 분주합니다. 그 후 플레이트를 배양하고, 4일마다 기존 배지를 흡입하여 제거한 뒤 새로운 분석 배지로 교체해 줍니다.

세포 증식을 평가하려면, 원하는 실험 시점에 분석 대상인 각 96-well plate의 well당 세포 증식 분석 키트의 cell titer 96 aqueous one solution 20 µL를 첨가합니다. plate를 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 ELISA plate reader를 사용하여 면역형광 분석 준비를 위해 실험군 및 대조군 well의 흡광도를 490 nm에서 측정합니다.

세포 신호 전달 분자 및 종양 세포 염색을 위해, 염색 수행 전날 4°C 냉장고에서 BME를 하룻밤 동안 해동합니다. 염색 당일, 8챔버 글라스 슬라이드 시스템을 층류 벤치(laminar hood) 내의 얼음 트레이 위에 놓습니다. 그다음, 200 µL 피펫을 사용하여 글라스 슬라이드 시스템의 각 웰에 차가운 BME 50 µL를 도포합니다.

BME가 고르게 도포되었는지 확인하고 웰 내에 기포가 생기지 않도록 합니다. 코팅된 슬라이드를 20분 동안 배양합니다. 휴면 또는 전이성 종양 세포주 중 하나를 선택합니다.

앞서 설명한 대로 trypsin을 사용하여 세포를 회수합니다. 그 다음, 배양할 전체 세포 수를 15 milliliter 원추형 튜브에 모읍니다. 이제 세포를 원심 분리하고, 배지를 소량 남긴 채 상층액을 다시 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

펠렛을 얻기 위해 15 mL 원추형 튜브의 바닥을 톡톡 쳐서 단일 세포 부유액을 만듭니다. 세포 5 × 10³개당 400 µL의 분석 배지를 사용하여 펠렛을 재부유시킵니다. 단일 세포 부유 상태가 유지되도록 5 mL 피펫으로 세포를 여러 번 파이펫팅합니다. BME가 코팅된 8개의 챔버 각 웰에 세포 용액 400 µL씩 분주합니다.

그 다음 유리 슬라이드 시스템을 배양하고, 기존 배지를 흡입하여 제거한 뒤 원하는 실험 시점마다 4일 간격으로 새로운 분석 배지를 공급합니다. 배지의 상층액을 흡입하여 제거하고 Triton이 첨가된 고정액 200 microliters를 가한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다. 이어서 Triton이 첨가된 고정액을 흡입하여 제거하고 고정액만 200 microliters 가하여 상온에서 25분 더 배양합니다.

고정액을 다시 흡입하여 제거한 후, 각 웰에 400 µL의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 더 배양합니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 400 µL를 추가하여 다시 10분 동안 배양합니다.

마찬가지로 상온에서 진행합니다. 이제 고정된 세포에 200 µL의 블로킹 용액을 넣어 블로킹합니다. 그 후 세포를 상온에서 1시간 동안 배양하고, 배양이 끝나면 블로킹 용액을 흡입하여 제거한 뒤 블로킹 용액에 희석한 1차 항체 200 µL를 각각 추가합니다.

슬라이드를 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 처리합니다. 항체를 흡입하여 제거하고, 400 µL의 PBS를 추가하여 15분 동안 세척한 뒤 용액을 흡입하여 제거하는 과정을 3회 반복합니다. 마지막 세척 후 PBS를 흡입하여 제거하면, rhodamine red가 결합된 2차 항체 200 µL를 추가합니다.

그런 다음 8-챔버 슬라이드 시스템을 알루미늄 호일로 덮고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 웰을 PBS로 3회 세척한 후, 세 번째 세척이 끝나면 dpi가 포함된 beta shield 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다.

마지막으로 슬라이드를 암실의 상온에서 40분 동안 건조합니다. 여기 3D 배양 내 휴면 상태의 D 2.0 R 및 전이성 D two A one 종양 세포의 증식 분석 예시가 나와 있습니다. D 2.0 R 세포는 14일의 전체 실험 배양 기간 동안 휴면 상태를 유지하는 반면, 전이성이 높은 D two A one 세포는 배양 후 4~6일 동안만 휴면 상태를 유지하며, 그 이후 초기 휴면 단계 동안 증식을 시작합니다.

4일 차 배양의 대표 사진에서 볼 수 있듯이 많은 세포가 3D 배양 내에서 단독 상태로 남아 있는 반면, 증식하지 않는 다른 세포들은 다세포성 구조체를 형성합니다. 3D 배양에서 D2A1 세포가 휴면 상태에서 증식 상태로 전환되는 모습이 여기 12일 차 배양 사진에 나타나 있습니다. 이는 이 그림에서 보이는 세포 형태의 급격한 변화와 관련이 있습니다.

D2A1 세포가 휴면 상태에서 증식 상태로 전환되는 것을 방지하는 약제의 예로, D2A1 세포에 myosin light chain kinase 특이적 억제제를 처리한 경우가 제시되어 있습니다. 이 그림에서와 같이 D2A1 세포를 휴면 상태로 유지합니다. 휴면기인 1~4일에서 증식기로 전환되는 동안, 빨간색으로 표시된 D2A1 세포 내 myosin light chain 인산화가 유의하게 증가하며, 이어서 초록색으로 표시된 F actin 필라멘트가 재구성되어 actin stress fiber를 형성합니다.

7일째입니다. 하지만 SHRA 또는 ML-7 약물을 사용하여 D2A1 세포의 myosin light chain kinase 활성을 차단하면, D2A1 세포가 휴면 상태로 유지되며, 여기에서 보는 바와 같이 myosin light chain 인산화, F-act 및 스트레스 섬유(stress fiber) 조직화의 억제가 일어납니다. 이 영상을 시청한 후에는 종양 휴면과 전이성 성장으로의 전환을 연구하기 위한 인 비트로(in vitro) 모델 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.