Name: 체외에서 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 3D 체외 배양 시스템을 활용하여 종양 세포의 휴면 상태와 전이성 성장 전환을 실시간 고속 분석하는 방법을. 이 기법은 암 재발 메커니즘 연구와 항전이 치료제 선별에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 휴지 및 전이성 종양 세포 라인의 세포 배양 관리 <ol><li> Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM) 높은 포도당와 10 % 태아 소 혈청을 (포함 10cm 문화 접시에 휴지 (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) 및 전이성 종양 세포를 (D2A1 / MDA - MB - 231 / K7M2) 성장 FBS)과 항생제. 세포 70-80%의 합류에 도달하면, 다음과 같은 assays로 진행합니다. </li></ol> 2. 휴지 (정지)과 전이성 (proliferating) 종양 세포의 세포 증식 분석은 3D - BME 시스템에 교양 3D 시스템에 Culturing 휴지 / 전이성 세포 <ol><li> 분석을 수행하기 전에 4 해동 Cultrex 성장 인자 - 감소 지하 막 추출 (BME)는 ° C 냉장고 밤. BME가 항상 얼음에 처리되어야합니다. </li><li> 다음날, 판상 후드 안에 얼음 트레이에 96 잘 접시를 놓으십시오. 주사기와 디스펜서를 사용하여 얼음 차가운 BME 50 - 100μl와 코트 각각 잘. 더 거품이 우물에 형성되지 있는지 확인합니다. 30 분 37 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 BME와 코팅 96 잘 판 ° C를 놓습니다. </li><li> 그동안 동면 또는 전이성 종양 세포 (섹션 1에 준비)에서 미디어를 대기음. 10 ML 인산이 호수, PH 7.4 (PBS)를 버퍼로 문화 접시 린스. 문화 접시에 PBS 및 추가 2ml 트립신 37 미리 예열 ° C를 대기음. 37 humidified 5 % CO 2에서 번호판을 품어 ° C, 5 분. </li><li> 10% FCS와 항생제로 보충 DMEM 높은 포도당의 5ml를 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 세포를 계산합니다. </li><li> 5 분 상온에서 1,500g의 속도로 조직 문화 원심 분리기에서 교양으로 전체 휴대폰 번호를 스핀 다운. 우리 assays 우리는 검사 각 세포주 또는 시점에 대해 / 잘 2X10 3 셀을 준비합니다. 그러나, 이것이 사용되는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음. 참고 대부분의 경우에 펠렛은 표시되지 않습니다. 따라서 일부 언론의 뒤에 둡니다. 단일 세포 현탁액을 얻은 것입니다 수 있도록 손가락으로 15ml 원뿔 튜브의 아래쪽을 누릅니다. 와 보충 항생제로 DMEM 낮은 포도당과 펠릿 다시 중단 2% FCS + 2 % BME (검정 미디어). 검정 미디어 100 μl마다 2x10 3 세포에 추가되어야합니다. 단일 세포 현탁액이 유지되도록 5ml 피펫으로 세포를 여러 번 씹다. </li><li> 플레이트 세포 혼합물의 100μl 당 자 96 자 BME 코팅 접시의 위에. 배경 평가 (섹션 2.8)를 추가 100μl의 판 당 우물의 96 잘 BME 코팅 접시 위에서만 분석 미디어. 37 humidified 5% CO 2 배양기에서 교양 96 잘 번호판을 품어 ° C. 세포는 분석 매체와 4 일마다 다시 먹이해야합니다. </li></ol> 확산 분석 : <ol start="8"><li> 세포의 확산 분석 : 원하는 시간에 우물에 추가 셀 Titer 96 수성 하나의 솔루션 세포 증식 분석 키트 20 μl를 가리 킵니다. 2 시간을위한 37 ° C에서 humidified 5% CO 2 배양기에서 알을 품다. 490nm에서 엘리사 플레이트 리더 기록 흡광도를 사용하여. 배경 평가 및 뺄셈 들어, BME와 우물 프리 코팅에 셀 Titer 96 수성 하나의 솔루션 세포 증식 분석 키트의 20μl를 추가하고 유일한 분석 매체와 입혔다. 490 NM에서 엘리사 플레이트 리더 기록 흡광도를 사용하여. </li></ol> 3. 및 / 또는 전이성 (proliferating) 휴지 (정지) 종양 세포가 종양 세포에 세포 신호 분자에 대한 Immunofluorescent 얼룩 immunfluorescence 얼룩을 위해 3D 시스템에 Culturing 휴지 / 전이성 세포 * 다음과 같은 프로토콜은 Debnath J 외 18 발행 3D 문화 프로토콜의 수정입니다. <ol><li> 같은 섹션 2.1에 설명된 BME를 준비합니다. 다음날 : 판상 후드 안에 얼음 트레이에 장소 8 챔버 유리 슬라이드 시스템을. 200μl pipetman를 사용하여 얼음처럼 차가운 BME의 50ul와 코트 각각 잘. BME가 고르게 확산이며 거품이 우물에 형성되지 있는지 확인합니다. 20 분 37 humidified 5 % CO 2에서 BME와 코팅 8 챔버 유리 슬라이드 ° C를 놓습니다. </li><li> 섹션 1과 섹션 2.3-2.4에서 설명한대로 문화에 준비에서 수확 동면 또는 전이성 세포. 15 ML 원뿔 관에 교양으로 세포의 총 수를 수집합니다. 우리는 검사 각 세포 라인과 시점에 대해 / 잘 오 X10 3 셀을 준비합니다. 5 분 상온에서 1,500g의 속도로 조직 문화 원심 분리기에있는 세포를 스핀 다운. 자세히 supernate를 대기음. 펠렛 볼하지 않습니다, 따라서 뒤에 어떤 미디어를 두십시오. 단일 세포 현탁액을 얻은 것을 보장하기 위해 손가락으로 15ml 원뿔 튜브의 아래쪽을 누릅니다.검정 미디어와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 검정 미디어 400μl마다 5x10 3 세포에 추가되어야합니다. 5ml 피펫으로 세포를 여러 번 씹다. 이 단계는 단일 세포 현탁액이 유지되도록하는 것은 매우 중요합니다. </li><li> BME와 코팅 8 실의 각 상단에 따라 잘 세포 혼합물의 플레이트 400μl. 37 humidified 5% CO 2 배양기에서 교양 8 실 유리 슬라이드 시스템을 품어 ° C. 세포는 분석 매체와 4 일마다 다시 먹이해야합니다. </li></ol> Immunofluorescence 염색법 : <ol start="4"><li> 원하는 시간 지점에서, 대중 매체의 상위 레이어를 대기음 4 %의 Paraformaldehyde (PFA), 5 % 자당 및 0.1 % 트리톤 X - 100을 포함하고있는 정착액의 200μl를 추가하고 5 분 실온에서 알을 품다. 정착액을 대기음 25 분 상온에서 5 %의 자당과 부화를 포함한 4퍼센트 PFA의 200μl를 추가합니다. </li><li> 정착액을 기음, 인산염의 추가 400 μl 각 잘하는 (PBS) 살린 버퍼. 실온에서 10 분 알을 품다. PBS를 대기음 400 μ PBS는 실온에서 10 분 트윈 20 0.05 %를 포함하는 추가합니다. </li><li> 10% 당나귀 혈청 중의 200μl 또는 1시간 (사용할 수 있도록 솔루션을 각 기본 항체에 대해 경험적으로 결정되어야 차단)을 3 % BSA와 함께 실온에서 고정 세포를 차단합니다. </li><li> 차단 솔루션을 기음과 주요 항체의 200μl을 (희석을 사용하여 각 기본 항체에 대해 경험적으로 결정한다)을 추가합니다. 10% 당나귀 혈청이 차단에 사용되는 경우 10 % 당나귀 혈청의 기본 항체를 희석하거나 3% BSA 차단 솔루션이 사용된 경우 3 % BSA의 기본 항체를 희석. 4 밤새 차 항체와 함께 품어 ° C. </li><li> 항체를 대기음, 15 분 동안 PBS 400μl로 우물을 세척하고 두 번 반복합니다. PBS를 기음과 rhodamine 빨간색 (희석이 경험적으로 결정한다)에 안티 - 각 - IgG 복합 당나귀의 200μl를 추가, 실온에서 1 시간 동안 알루미늄 호일과 부화로 8 챔버 슬라이드 커버. </li><li> 400μl PBS (각 씻어 3x15 분)와 우물을 씻으십시오. 대기음 PBS. VECTASHIELD는 DAPI와 매체 장착과 탑재. 어둠 속에서 실온에서 40 분 건조 슬라이드. 슬라이드 4 ° C. 1 주일 동안 보관 가능 어둠의 슬라이드를 저장합니다. 이미지 공촛점 현미경으로 슬라이드. </li></ol> 4. 대표 결과 : 3D 문화의 휴지 D2.0R 및 전이성 종양 D2A1 세포의 확산 분석 예제는 그림 1A에 표시됩니다. 높은 전이성 D2A1 세포는 그들이 세포 분열 따위에 의해 번식하기 시작 이후 4~6일 동안 수면 상태에 남아있는 반면 D2.0R 세포는 전체 실험 십사일 문화 시대를 통해 (정지) 휴면 수 있습니다. 다른 아닌 proliferating 세포가 여러 세포 spheroids을 형성하는 반면, 초기 잠복 단계 동안, 많은 전지 (일 4 그림 1B) 3 - D 문화의 독방 남아 있습니다. 3 - D의 문화에 proliferative 상태로 휴면에서 D2A1 세포의 전환 (그림 1B, 12 일) 셀 형태의 극적인 변화와 관련된 것입니다. 따라서,이 분석은 어떤 요소를 테스트하는 데 사용할 수있는 / S는 수면 상태에서 등장하는 휴면 D2.0R 세포를 실행할 수 있으며, 어떤 요소 것은 / s의 자신의 수면 상태에서 전환할 D2A1 세포를 방지할 수 있습니다. 그림 2는 에이전트의 예입니다 휴면에서 proliferative 상태로 전환하는 D2A1 세포를 방지. 그림 2에서 그림, 마이 오신 라이트 체인 키나제 (ML - 7)의 특정 억제제 D2A1 세포의 트리 트먼트는 휴면 상태에 D2A1 세포를 유지. 3D 시스템에 교양 동면 proliferating 종양 세포의 신호를 세포는 세포 신호 분자에 대한 immunofluorescence 얼룩으로 공부하실 수 있습니다. 그림 3에서 그림 굴지 스트레스 섬유 (녹색 얼룩)을 형성 F - 굴지의 필라멘트의 개편 다음 D2A1 셀 (빨간색 얼룩)에서 마이 오신 라이트 체인 인산화에 상당한 증가는 휴면으로부터 전환 (1-4 일) 동안 발생 확산 (일 7). 그러나, shRNA 또는 특정 약물 (ML - 7)에 의해 D2A1 세포의 마이 오신 라이트 체인 키나제의 활동을 차단하는 것은 D2A1 휴면 상태에있는 세포와 마이 오신 경쇄 인산화 및 F - 굴지 스트레스 섬유 조직 (그림 4)의 억제에 결과를 유지합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 독방 종양 세포 휴면 및 전이성 성장에 스위치를 공부 체외 모델 인치 3 - D Cultrex BME의 휴면 D2.0R 및 전이성 D2A1의) 확산, N = 8 (± SE를 의미). 세 실험 (* P ≤ 0.05)의 대표적인 결과입니다. B) D2.0R 및 D2A1 세포의 라이트 현미경 이미지는 3 - D Cultrex BME의 배율 x20에서 교양.그림 Barkan 외 17 수정되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마이 오신 라이트 체인 키나제 (MLCK)의 억제에 의해 3D 문화 시스템의 확산에 휴지 (정지)에서 D2A1 세포의 스위치를 예방. 3 - D Cultrex BME, N의 교양 D2A1 세포 증식의 시간 코스 = 8 (± SE를 의미). 전지 (제어) 치료했다, 또는 MLCK의 특정 억제제 (ML - 7, 5 μm의)와 함께 치료를 문화의 날 5 48 시간부터 시작하십시오. 그림 Barkan 외 17 수정되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 마이 오신 경쇄 인산화은 proliferative 성장 휴면에서 D2A1 세포의 스위치 중에 F - 굴지의 개편으로 따라갔다. D2A1 전지는 8 챔버 유리 슬라이드에 3 - D Cultrex BME에 교양되었습니다. 세포 고정과 핵 지방화를위한 DAPI (파란색), F - 굴지에 대한 phalloidin (녹색)과 같은 다양한 시간 지점에서 지적 마이 오신 라이트 체인 (MLC - P) (적색)의 phosphorylated 양식에 대한 항체 물들일되었습니다. F - 굴지 및 MLC - P의 얼룩 (노란색)의 병합. MLC - P 표현은 굴지 스트레스 섬유 형성 (화살표) 다음 proliferative 성장 (일 7) 휴면 (days1 - 4)에서 D2A1 세포의 이행 기간 동안 증가했다. 공촛점 현미경, 확대 x63. 화이트 막대는 20 미크론 같습니다. 그림 Barkan 외 17 수정되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. . 문화의 날 48 시간의 시작을 위해, 마이 오신 라이트 체인 키나제 (MLCK) D2A1 세포 중재 F - 굴지 스트레스 섬유 형성의 억제 D2A1 세포 (제어) 치료했다, 또는 MLCK (5 μm의 ML - 7)에 대한 억제제로 치료 5 또는 발진 또는 MLCK shRNA 취급 및 마이 오신 라이트 체인 (MLC - P) (적색), F - 굴지 (녹색), 그리고 핵 (파란색)의 phosphorylated 양식 스테인드. F - 굴지 및 MLC - P의 얼룩 (노란색)의 병합. 공촛점 현미경, 확대 x63. 화이트 막대는 20 미크론 같습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전이성 성장하기 위해 전환에 휴면 상태 또는 결과 종양 세포를 전파 관리 기본 메커니즘은 크게 알려지지 않은 상태로 유지됩니다. 이러한 현상은 인간의 환자 4,12 그리고 몇 잠복기 모델이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다에서 공부하는 것은 매우 어려운되었습니다. 그럼에도 불구하고, 생체내 및 종양 휴면에 대한 전 생체내 모델 시스템의 일부 (1,12에서 검토) 특징되었습니다. 그러나, 종양이 휴면에 대한 생체내 모델은 주로 종양 휴면을 규제하는 잠재적인 메커니즘을 검증하기 위해 이용하지만, 실시간으로 하나의 전파 휴면 종양 세포의 생물학을 탐구 의무가 없습니다 수 있습니다. 3 - D 시스템이 처음으로 독방에 종양의 휴면과 체외 모델 시스템에서 전이성 성장을 스위치 여기 모델 제시. 모델링 종양의 휴면 (정지)와 3D 시스템의 확산로의 전환에 대한 확산 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 낮은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> 성장 인자 - 삭감 3 - D Cultrex의 지하 막 추출 </td><td> Trevigen 주식 회사 </td><td></td><td> 14-15mg/ml 간의 단백질 농도 </td></tr><tr><td> D2.0R 및 D2A1 세포 라인 </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 및 K7M2AS1.46 세포 </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF - 7과 MDA - MB - 231 유방암 세포 </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 챔버 유리 슬라이드 시스템 </td><td> (랩 - 테크, 써모 과학) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 Titer 96 수성 한 솔루션 세포 증식 분석 키트 </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD는 DAPI로 미디어를 장착 </td><td> 벡터 연구소 주식 회사 </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td> 일반 당나귀 혈청 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> 엘리사 플레이트 리더 </td><td> 바이오 테크 </td><td></td><td> 기록 490nm </td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 - LSM - 510 </td><td></td><td> 확대 x63 </td></tr></tbody></table>

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

유방암의 재발은 종종 암의 흔적이 없다는있는 긴 잠재 기간을 다음과 metastases는 기본 종양과 도움이되는 치료의 제거 후 수년 전까지는 임상적으로 명백한 될 수 없습니다. 이러한 현상의 가능성이 설명은 종양 세포가 전이성 사이트 씨앗 기존 치료에 저항하고, 시간이 1-4 오랜 기간 동안 휴면 남아있다는 것입니다. 보조 사이트에서 휴지 암세포의 존재는 둘 다 분아 따위에 의해 번식하지 않으며 apoptosis가 5-7 받아야 정지 독방 세포로 이전에 설명되었습니다. 또한, 이러한 고독한 세포는 질병의 진행의 80-10의 초기 단계에서 기본 종양에서 보급하고 환자의 골수, 혈액, 림프절 1,4,11에서 성장 체포 거주 보여왔다. 따라서, proliferative 상태로 휴면 또는 스위치를 조절 메커니즘을 이해하는 것은 질병 재발을 방지하기 위해 새로운 목표와 중재를 발견하기위한 중요합니다. 그러나, 전이성 종양 성장에 휴면에서 스위치를 조절 메커니즘을 분열하는 것은 가능한 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 생체내 및 종양 세포의 전이성 진행을 공부하기 전 생체내 모델 시스템에서 이전에 설명한 1,12-14되었습니다. 그러나 이러한 모델 시스템은 실시간 및 전이성 질환으로 세포 분열 따위에 의해 번식하는 고독한 휴면 종양 세포의 출현을 트리거 무엇으로 높은 처리량 방식의 기계론의 통찰력에서 제공하지 않았습니다. 우리는 최근 (D2A1, MDA - MB - 231, K7M2) 중 휴면 (D2.OR, MCF7, K7M2 - AS.46) 또는 proliferative 전이성 동작을 세포의 생체내 성장 특성 모델 체외 시스템에서 3D를 개발 생체내 인치 우리는 전이성 사이트에서 생체내의 휴면을 전시 종양 세포가 3 차원 (3D) 지하 막 추출물 (BME)에서 양식 때 생체내 높은 전이성 세포가 쉽게 변수 후 3D 문화 분아 따위에 의해 번식하는 반면, 정지 남아 있지만, 상대적으로 짧은 것을 보여주 정지의 기간. 중요한 시험 관내 모델 시스템에서 3D를 이용하여 우리는 ECM 성분이 휴면 종양 세포가 proliferative 상태로 전환되며, 생체내 연구 15-17에서에서 이것을 확인했는지 여부 조절에 중요한 역할을하는 처음으로 보여주었다. 따라서이 보고서에서 설명하는 모델 시스템 모델 종양의 휴면을 체외 방식의를 제공하고 microenvironment에 의해 유도된 proliferative 성장로의 전환을 공부합니다.

체외 시스템에 수정 3 - D는 재구성 지하 막 여러 종양 세포 라인의 성장 특성 전이성 보조 사이트에서 종양 세포의 휴지 또는 proliferative 행위와 연관있는 제공됩니다<em&gt; 생체내에</em&gt;.

유방암의 재발은 암의 징후가 나타나지 않는 긴 잠복기 이후에 빈번히 발생하며, 전이는 임상적으로 뚜렷하게 나타나지 않을 수 있습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 종양 휴면 또는 전이성 성장으로의 전환을 모델링하는 다음과 같은 in vitro 분석법을 사용하여, 잠재적 약물이 종양 세포의 휴면 및/또는 휴면 상태에서의 탈출에 미치는 영향을 실시간 및 고처리량 방식으로 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 플레이트 플랫폼에 맞게 조정된 3차원 배양 기저막 추출물(BME) 시스템에서 휴면 및/또는 전이성 종양 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 3D 시스템에서 배양될 때, 전이성 세포는 일시적인 휴면 또는 정지기 단계로 진입합니다.이와 대조적으로, in vivo에서 휴면 상태인 종양 세포는 장기간의 정지 상태로 진입합니다. 3D 배양 시스템에서 전이 세포는 정지 상태에서 증식 상태로의 전환을 방지하기 위해 후보 약물로 처리될 수 있습니다. 반면, 휴면 종양 세포는 정지 상태에서 증식 상태로의 전환을 유도할 수 있는 후보 약물로 처리될 수 있습니다.처치 결과에 따른 휴면 및 전이 세포의 증식 거동은 분석 희망 시점에 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit를 첨가한 후 ELISA 플레이트 리더로 분석하여 측정합니다. 이를 통해 3D 시스템 내 세포 증식 분석을 바탕으로 휴면 또는 전이성 종양 세포의 세포 증식에 미치는 처치 효과에 대한 결과를 얻습니다. 이 방법은 전이 분야의 핵심 질문, 즉 어떤 요인과 세포 기전이 전이성 종양 세포를 휴면 상태로 유지시키는지, 그리고 어떤 요인과 세포 기전이 종양 휴면 상태에서 임상적 전이로의 전환을 유도하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.증식 분석을 수행하기 전날, 성장 인자가 제거된 BME를 4 °C 냉장고에 넣고 하룻밤 동안 보관합니다. 그 다음 분석 당일에, 휴면성 또는 전이성 종양 세포 배양액 중 하나를 실험용으로 선택합니다. 이어서 96-웰 플레이트를 층류 후드 내 얼음 트레이 위에 놓습니다.그런 다음 시린지가 장착된 디스펜서를 사용하여 플레이트의 각 웰에 해동된 얼음처럼 차가운 BME 50 µL를 코팅합니다. 웰에 기포가 생기지 않도록 주의하며, BME가 코팅된 96 웰 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 가습 배양기에 30분 동안 넣습니다. BME 코팅 플레이트가 배양되는 동안 trypsin 병을 37 °C에 두어 가온합니다.종양 세포로부터 배지를 흡입하여 제거합니다. 배양 플레이트를 10 milliliters의 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 예열된 trypsin 2 milliliters를 배양 플레이트에 첨가합니다.플레이트를 5분 동안 배양합니다. 10% FCS와 항생제가 보충된 DMEM high glucose 5 mL를 15 mL 원심분리관에 넣습니다. 이 시간 동안.배양 후, 분리된 세포를 15 milliliter 튜브로 옮기고 세포 수를 측정합니다. 그 다음, 조직 배양용 원심분리기를 사용하여 상온에서 1500 G로 5분 동안 원심분리하여 배양할 전체 세포를 침전시킵니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.대부분의 경우 펠릿이 보이지 않으므로 배지를 약간 남겨둡니다. 그런 다음 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 단일 세포 현탁액이 되도록 합니다. 다음으로, 2 × 10³개의 세포당 100 µL의 분석 배지를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.단일 세포 현탁액 상태가 유지되도록 5 mL 피펫으로 세포를 여러 번 트리투레이션(triturate)합니다. 대조군 배경값 측정용 96-웰 BME 코팅 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL씩 분주합니다. 96-웰 BME 코팅 플레이트의 일부 웰에는 분석 배지만을 웰당 100 µL씩 추가로 분주합니다. 그 후 플레이트를 배양하고, 4일마다 기존 배지를 흡입하여 제거한 뒤 새로운 분석 배지로 교체해 줍니다.세포 증식을 평가하려면, 원하는 실험 시점에 분석 대상인 각 96-well plate의 well당 세포 증식 분석 키트의 cell titer 96 aqueous one solution 20 µL를 첨가합니다. plate를 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 ELISA plate reader를 사용하여 면역형광 분석 준비를 위해 실험군 및 대조군 well의 흡광도를 490 nm에서 측정합니다.세포 신호 전달 분자 및 종양 세포 염색을 위해, 염색 수행 전날 4°C 냉장고에서 BME를 하룻밤 동안 해동합니다. 염색 당일, 8챔버 글라스 슬라이드 시스템을 층류 벤치(laminar hood) 내의 얼음 트레이 위에 놓습니다. 그다음, 200 µL 피펫을 사용하여 글라스 슬라이드 시스템의 각 웰에 차가운 BME 50 µL를 도포합니다.BME가 고르게 도포되었는지 확인하고 웰 내에 기포가 생기지 않도록 합니다. 코팅된 슬라이드를 20분 동안 배양합니다. 휴면 또는 전이성 종양 세포주 중 하나를 선택합니다.앞서 설명한 대로 trypsin을 사용하여 세포를 회수합니다. 그 다음, 배양할 전체 세포 수를 15 milliliter 원추형 튜브에 모읍니다. 이제 세포를 원심 분리하고, 배지를 소량 남긴 채 상층액을 다시 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.펠렛을 얻기 위해 15 mL 원추형 튜브의 바닥을 톡톡 쳐서 단일 세포 부유액을 만듭니다. 세포 5 × 10³개당 400 µL의 분석 배지를 사용하여 펠렛을 재부유시킵니다. 단일 세포 부유 상태가 유지되도록 5 mL 피펫으로 세포를 여러 번 파이펫팅합니다. BME가 코팅된 8개의 챔버 각 웰에 세포 용액 400 µL씩 분주합니다.그 다음 유리 슬라이드 시스템을 배양하고, 기존 배지를 흡입하여 제거한 뒤 원하는 실험 시점마다 4일 간격으로 새로운 분석 배지를 공급합니다. 배지의 상층액을 흡입하여 제거하고 Triton이 첨가된 고정액 200 microliters를 가한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다. 이어서 Triton이 첨가된 고정액을 흡입하여 제거하고 고정액만 200 microliters 가하여 상온에서 25분 더 배양합니다.고정액을 다시 흡입하여 제거한 후, 각 웰에 400 µL의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 더 배양합니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 400 µL를 추가하여 다시 10분 동안 배양합니다.마찬가지로 상온에서 진행합니다. 이제 고정된 세포에 200 µL의 블로킹 용액을 넣어 블로킹합니다. 그 후 세포를 상온에서 1시간 동안 배양하고, 배양이 끝나면 블로킹 용액을 흡입하여 제거한 뒤 블로킹 용액에 희석한 1차 항체 200 µL를 각각 추가합니다.슬라이드를 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 처리합니다. 항체를 흡입하여 제거하고, 400 µL의 PBS를 추가하여 15분 동안 세척한 뒤 용액을 흡입하여 제거하는 과정을 3회 반복합니다. 마지막 세척 후 PBS를 흡입하여 제거하면, rhodamine red가 결합된 2차 항체 200 µL를 추가합니다.그런 다음 8-챔버 슬라이드 시스템을 알루미늄 호일로 덮고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 웰을 PBS로 3회 세척한 후, 세 번째 세척이 끝나면 dpi가 포함된 beta shield 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다.마지막으로 슬라이드를 암실의 상온에서 40분 동안 건조합니다. 여기 3D 배양 내 휴면 상태의 D 2.0 R 및 전이성 D two A one 종양 세포의 증식 분석 예시가 나와 있습니다. D 2.0 R 세포는 14일의 전체 실험 배양 기간 동안 휴면 상태를 유지하는 반면, 전이성이 높은 D two A one 세포는 배양 후 4~6일 동안만 휴면 상태를 유지하며, 그 이후 초기 휴면 단계 동안 증식을 시작합니다.4일 차 배양의 대표 사진에서 볼 수 있듯이 많은 세포가 3D 배양 내에서 단독 상태로 남아 있는 반면, 증식하지 않는 다른 세포들은 다세포성 구조체를 형성합니다. 3D 배양에서 D2A1 세포가 휴면 상태에서 증식 상태로 전환되는 모습이 여기 12일 차 배양 사진에 나타나 있습니다. 이는 이 그림에서 보이는 세포 형태의 급격한 변화와 관련이 있습니다.D2A1 세포가 휴면 상태에서 증식 상태로 전환되는 것을 방지하는 약제의 예로, D2A1 세포에 myosin light chain kinase 특이적 억제제를 처리한 경우가 제시되어 있습니다. 이 그림에서와 같이 D2A1 세포를 휴면 상태로 유지합니다. 휴면기인 1~4일에서 증식기로 전환되는 동안, 빨간색으로 표시된 D2A1 세포 내 myosin light chain 인산화가 유의하게 증가하며, 이어서 초록색으로 표시된 F actin 필라멘트가 재구성되어 actin stress fiber를 형성합니다.7일째입니다. 하지만 SHRA 또는 ML-7 약물을 사용하여 D2A1 세포의 myosin light chain kinase 활성을 차단하면, D2A1 세포가 휴면 상태로 유지되며, 여기에서 보는 바와 같이 myosin light chain 인산화, F-act 및 스트레스 섬유(stress fiber) 조직화의 억제가 일어납니다. 이 영상을 시청한 후에는 종양 휴면과 전이성 성장으로의 전환을 연구하기 위한 인 비트로(in vitro) 모델 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

종양 개시 세포(TIC)는 재발성이 높고 치명적인 질병인 난소암 치료를 위한 실행 가능한 치료 표적이 될 수 있습니다. 우리는 이 고도의 종양 형성 세포 집단을 풍부하게 하는 배양 조건에 대한 프로토콜을 제시합니다.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

우리는 에스트로겐에 민감한 유방암 세포에 대한 골수의 휴면에 대한 체외 모델을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 휴면 상태의 분자 및 세포 생물학 연구와 생체 내 후속 테스트를 위한 가설 생성을 위한 모델 사용을 입증하는 것입니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구

비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

이 원고는 종양 저산소증이 전이에 미치는 영향을 직접 테스트하고 그 작용 메커니즘을 해독할 수 있는 동물 모델의 개발을 설명합니다. 여기에 설명된 실험은 유잉 육종에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종양 유형에도 유사한 접근법을 적용할 수 있습니다.

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

배우세요 3D 체외 배양 시스템을 활용하여 종양 세포의 휴면 상태와 전이성 성장 전환을 실시간 고속 분석하는 방법을. 이 기법은 암 재발 메커니즘 연구와 항전이 치료제 선별에 활용됩니다.

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