신생아 Hypoxia의 생화 학적 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 신생아 저산소성 허혈의 생화학적 마커를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 혈장을 분리하기 위해 유아의 혈액 샘플을 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 일부 혈장을 여과하고 내부 표준물질과 결합하고 HPLC 2에서 하이포잔틴, 산틴 및 요산 농도를 분석합니다.

그런 다음 더 많은 혈장 분취액이 차등적으로 처리되고 별도로 분석됩니다. GCMS의 알란토인 농도 및 MDA 수치의 경우, 절차의 마지막 단계는 플라즈마의 일부를 기질과 결합하여 반응을 담금질한 후 효소 반응을 시작하는 것입니다. xanthe oxidase의 활성은 형광 검출기가 장착된 HPLC에서 측정할 수 있습니다.

궁극적으로 피크 영역의 크로마토그램을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이는 표준 곡선을 통해 원하는 생화학적 마커 또는 효소 활성의 몰 농도로 변환될 수 있습니다. 이 방법의 의미는 신생아 저산소증 허혈의 치료 및 진단으로 확장되는데, 그 이유는 이 방법이 에너지 결핍, 산화 스트레스, 산화 손상 및 효소 활성의 마커 측정을 결합하여 이 절차를 시작하기 전에 저산소성 허혈의 존재 및 정도에 대한 전반적인 생화학적 그림을 생성하기 때문입니다. 출생 직후 신생아의 혈액 샘플을 6ml EDTA 튜브에 넣어 5분 이내에 채취합니다.

채취 후에, 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하고 1, 10 분 동안 500배 G. supinate에 존재하는 혈장을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 30분 동안 원심분리기를 합니다. 샘플을 적혈구로 오염시키지 않도록 주의하면서 supinate를 제거합니다.

Eloqua는 퓨린의 각 PLC 측정을 위해 퓨린 라닌, MDA 및 크산테 산화효소 분석을 위해 샘플을 별도의 마이크로 센트리 튜브에 넣습니다. 200마이크로리터의 플라즈마를 원심 필터 장치로 옮깁니다. 4 섭씨 온도와 14, 000 시간 동안 G 시간에 플라스마의 분리기.

여과액을 제거하고 두 개의 아이노 퓨린이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 농도를 정확하게 측정하기 위해 두 개의 AP.To 이 들어있는 마이크로 원심분리기 튜브에 첨가된 여과액의 양을 기록해야 합니다. 10-20초 동안 튜브를 소용돌이

결과 크로마토그램에서 각 샘플에 대해 3번의 50마이크로리터 주입을 사용하여 서면 프로토콜에 설명된 대로 HPLC로 샘플을 분석합니다. 샘플에서 퓨린의 농도를 측정합니다. hypoxanthine, xanthine 및 uric acid는 해당 머무름 시간과 파장에서 피크 면적을 얻어 정량화합니다.

다음으로, 두 ap의 피크 면적을 정량화합니다. 이 정보에서 두 AP에 대한 하이퍼 크산틴과 요산의 면적 비율을 계산할 수 있습니다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 비율을 마이크로몰 농도로 변환합니다.라닌 측정을 수행하려면 내부 표준물질 50마이크로리터와 아세토 니트릴 100마이크로리터를 플라즈마 50마이크로리터에 추가합니다.

혼합물을 10-20 초 동안 볼텍싱 한 후. 원심분리 후 10분 동안 원심분리기. supinate를 제거하고 GCM S 바이알에 넣습니다.

질소 가스에서 액체를 건조시킵니다. 액체가 건조되면 25마이크로리터의 화제인 M-T-B-S-T-F-A와 25마이크로리터의 피리딘을 첨가합니다. 바이알의 뚜껑을 닫고 섭씨 50도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 300마이크로리터 인서트를 사용하여 샘플을 다른 GCMS 바이알로 옮깁니다. 자동 샘플러를 사용하여 GCMS의 샘플을 분석합니다. 헬륨을 운반 가스로 사용하여 분당 1.5ml의 유속으로 화합물 분리를 수행합니다.

GCMS 분석을 시작하려면 실행에 대한 매개변수를 입력합니다. 초기 컬럼 온도를 섭씨 100도로 설정하고 해당 온도를 2분 동안 유지한 후 분당 섭씨 10도의 비율로 섭씨 180도로 높입니다. 온도를 4분 동안 유지한 다음 분당 섭씨 20도의 비율로 섭씨 260도까지 높입니다.

주행이 끝날 때까지 이 온도를 유지하십시오. 자동 샘플러를 사용하여 분할 모드에서 1마이크로리터의 DERIVATIZED 제품을 주입하고 각 샘플 실행 사이에 실행을 수행합니다. 자동 샘플러가 M-T-B-S-T-F-A 피리딘을 1-1회 2회 주입하여 컬럼을 세척하도록 합니다.

LAN toin을 정량화하려면 이온 모니터링 모드를 선택하고 Atlanto in에 대한 3 98 마스터 전하 비율 이온과 Heavy Atlanto in에 대한 400 마스터 전하 비율을 모니터링합니다. 그런 다음 MDA를 측정하기 전에 준비된 표준 곡선을 사용하여 아틀란토의 이온 풍부도를 아틀란토의 마이크로몰 농도로 변환하고, 서면 프로토콜에 설명된 대로 부틸화 하이드록실 톨루엔 및 50밀리몰 페닐 히드라진 용액을 준비합니다. 100마이크로리터 혈장 샘플에 M-M-D-A-B-H-T 및 구연산나트륨을 추가합니다.

증류수 탈이온수를 첨가하여 최종 혼합물을 480마이크로리터로 희석합니다. 20 마이크로 리터의 50 밀리 몰 페놀 히드라진을 첨가하여 용액을 유도체화합니다. 바이알을 뚜껑을 씌운 후 오비탈 셰이커에서 용액을 배양합니다.

배양 후 1 ml의 헥산 와류를 혼합물에 1 분 동안 첨가하고 10 분 동안 분당 3000 회전으로 원심 분리합니다. 원심분리 후 유기층을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 질소 가스 흐름 아래에서 증발하여 용액을 100마이크로리터로 농축하고 300마이크로리터 인서트를 사용하여 A-G-C-M-S 파일로 이동합니다.

다음으로, 작성된 절차에 설명된 대로 MDA의 화합물 분리 및 정량화를 수행하는 자동 샘플러를 사용하여 A-G-C-M-S의 샘플을 분석합니다. 혈장 시료를 위한 두 개의 바이알을 준비하여 santhe oxidase 활성의 검출을 시작합니다. 하나는 대조군으로 기질을 0분 동안 배양하고 다른 하나는 4시간 동안 배양합니다.

실험으로 각 튜브에 버퍼와 기질을 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 5분 동안 사전 배양합니다. 각 튜브에 60마이크로리터의 혈장을 추가하여 효소 반응을 시작합니다.

즉시 염소산 당 300 마이크로 리터의 4 %를 제로 인큐베이션 튜브에 첨가하십시오. 반대로, 염소산을 첨가한 후 반응을 담금질하기 전에 다른 혼합물을 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하도록 합니다. 제로 인큐베이션 제어 튜브를 소용돌이치고 원심분리를 따릅니다.

500마이크로리터의 supinate를 제거하고 20마이크로리터의 5몰 탄산칼륨이 들어 있는 튜브에 첨가하여 반응 와류, 중화된 샘플 및 원심분리기를 두 번째로 중화합니다. 그런 다음 350마이크로리터의 중화 용액을 두 개의 ap가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 4 시간 샘플을 배양 한 후 염소산 당 4 %의 300 마이크로 리터를 첨가하여 반응을 냉각시킵니다.

대조군 샘플에 대해 수행된 대로 샘플의 처리를 계속합니다. 주사 형광 검출기가 장착된 HPLC에서 샘플을 분석합니다. 를 사용하여 매개변수를 입력하십시오 소크라테스 조건 분당 1밀리리터의 유속으로 말입니다.

적절한 피크 분리 및 식별을 얻으려면 형광 검출기 여기 파장을 340나노미터로 설정하고 방출 파장을 410나노미터의 3 50으로 설정합니다. HPLC 실행 후 각 샘플에 대해 HPLC에서 마이크로리터 주입이 실행됩니다. 형광 검출기 스펙트럼에서 피크 면적을 얻어 두 AP에 대한 ISO terin의 비율을 결정합니다.

약 5분 시점의 스펙트럼에서 첫 번째 피크는 2개의 ap에 해당합니다. 두 번째이자 가장 큰 봉우리는 테란이 될 것입니다. ISO antho terin 피크는 마지막으로 용리되며, 0과 4 시간 배양 시간 지점 사이의 ISO ANTOIN 두 AP 피크 면적 비율의 차이를 얻습니다.

이 값을 사용하여 표준 곡선에서 크산틴 산화효소 활성을 계산합니다. 퓨링 화합물의 HPLC 정량화의 예는 요산, 하이포잔틴 및 크산틴의 특정 머무름 시간과 방출 파장이 퓨린 화합물의 동시 정량을 가능하게 하는 것과 같습니다. 분석이 올바르게 실행되면 화합물이 적절하게 분리되고 피크 모양이 날카롭고 단봉적이 됩니다.

HPLC 시스템에 기포가 있는 경우 머무름 시간이 변경되고 HPLC 압력이 크게 변동합니다. 가드 카트리지를 교체해야 하는 경우 압력이 증가하고 피크가 넓어지며 여기 예와 같이 by 또는 trimodal이 됩니다. 라닌의 GCMS 정량화의 예는 massive derivatized, lanin 및 derivatized, heavy lanin이 알려져 있기 때문에 표시됩니다.

이온 모드 선택은 질량 분석기에서 이러한 화합물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 분석이 올바르게 수행되면 동일한 머무름 시간에서 두 개의 피크가 관찰됩니다. 한 피크는 Alan Toin에 해당하고 다른 피크는 Heavy Toin에 해당합니다.

MDA의 정량화 결과는 두 피크가 서로 다른 머무름 시간에서 관찰된다는 점을 제외하고는 Alan Toin의 결과와 유사합니다. 여기서, MDA에 대한 144 마스터 전하비 피크 및 MMDA에 대한 158 마스터 전하비 피크가 관찰된다. xanthe oxidase 기능의 HPLC 기반 정량화의 예는 0분 배양 시간과 4시간 배양 시간에서 입증됩니다.

분석이 올바르게 실행되면 형광 검출기로 3개의 피크, 즉 2개의 ap에 대해 1개, Terran에 대해 1개, ISO terin에 대해 1개의 피크를 관찰해야 합니다. 4시간 배양 시간 동안 ISO terin 피크가 높을수록 santhe oxidase 효소 활성이 증가하기 때문입니다. 이 분석법은 효소 기능을 측정하기 때문에 시료의 동결 및 해동을 반복하면 이것이 변경될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신생아 저산소증 허혈의 여러 생화학적 마커를 정확하게 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.