Name: 부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 부분 췌장절제술 환자에서 인간 아일렛을 분리하는 방법을. 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 사용하여 당뇨병 및 비당뇨 환자의 아일렛을 분리하고 생존성을 유지하는 프로토콜입니다.

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우리는 프로젝트의 다양한 단계에 도움을 조언하고 중요한 입력을 제공하는 우리의 수많은 동료들을 감사드립니다. 이 비디오 문서의 생산은 당뇨병 연구 (DZD을위한 독일 센터 교육 및 연구 (BMBF)의 독일 교육부로부터 자금을 지원했습니다 <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) 기술 드레스덴 대학에서 대학 병원 칼 구스타프 카루스. 이 결과에 이르는 연구를 부여 계약 N ° 115,005에서 혁신적인 의학 이니셔티브에 대한 유럽 공동체의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 자금을 받았습니다.

1. 수술실에 췌장 조직 모음 <ol><li> 외과는 췌장의 부분 절제술을 수행합니다. </li><li> 얼음 상자에 췌장 표본을 배치 후, 병리학자에게 즉시 제공합니다. </li></ol> 2. 아일릿 격리에 대한 조직 선택 <ol><li> 병리학자는 진단 목적으로 손상된 조직을 유지, 부드럽고 건강한 나타나는 조직을 선택합니다. Fibrotic 조직과 유용성을 조직 미만 2g을 제공하는 표본은 아일릿 격리에서 제외됩니다. </li><li> 유로 콜린스 솔루션의 췌장 조직을 담가와 실험실에 얼음 제공합니다. </li></ol> 3. 인간 아일 레츠의 분리 <ol><li> 췌장 조직의 무게를, 다음 10cm 접시에 넣습니다. </li><li> 500 ML 플라스크에 150 ML RPMI 미디어를 넣어. </li><li> 250 ML 플라스크에 100 MG / ML DNase 및 5mg/ml의 Liberase의 RI 20 ML 130 ML RPMI 미디어를 결합하여 소화 효소 솔루션을 준비합니다. 췌장 조직을 주입하는 주사기로이 솔루션의 10 ML을 그립니다. </li><li> homogeneously을 넓히다 목표로, 췌장 조직에 소화 효소 솔루션을 주사. 이것이 섬유증의 예방 경우, 소화 가능성이 높습 실패합니다. 다음 ~ 4mm에 얼음 3 조각을 조직을 말하다. </li></ol> 4. 인간 췌장의 소화 회로 <ol><li> 그림 1에서와 같이 소화 회로를 조립. Ricordi 챔버의 흐름 방향은 챔버의 상단에 아래와 밖에서 있습니다. </li><li> 300 ML 총 볼륨에 500 ML 플라스크에 남아있는 소화 효소 솔루션을 추가하고 온도계를 삽입합니다. </li><li> , 챔버에 췌장 조직을 전송 메쉬 (구멍 지름 : 600 μm의)를 삽입 세 실리콘 질화물 구슬 (직경 : 15mm)는 챔버를 닫고 140 ML / 분 설정 흐름과 펌프를 시작합니다. </li><li> 회로의 온도가 37에 도달하면 ° C, 타이밍을 시작하고 정기적으로 소화를 중지 시기를 결정하는 샘플을 채취. dithizone (2 MG / ML)로 얼룩하면 소화 조직 4 시간 아일 레츠의 미세한 시각화 수 있습니다. </li><li> 아일 레츠가 주변 acinar 조직에서 분리되면, 얼음에 가열 코일을 배치하고 회로에 감기 세척 미디어 200 ML (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640)를 추가하여 소화를 빠르게를 중지합니다. </li><li> 이 샘플 튜브 나오는 등 250 ML 원뿔 튜브에 아일릿 솔루션을 수집합니다. 회로가 비어 때까지 계속합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 세 실리콘 질화물 구슬 (직경 : 15mm) : 인간의 췌장의 소화 회로는 인간의 췌장의 소화 회로는 메쉬 (600 μm의 구멍 직경)이있는 Ricordi 챔버를 포함합니다. 챔버의 유출은 연동 펌프 (140 ML / 분)에 의해 조직 수집 플라스크로 구동됩니다. 화살표는 흐름 방향을 나타냅니다. 효소 소화를위한 최적 온도는 37 ° C의 물을 욕조에 가열 코일을 immersing에 의해 유지됩니다. 5. 포스트 소화를 워싱 <ol><li> 5 분 1,000 RPM에서 아일릿 솔루션 4 ° C를 포함하는 250 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640) 씻어 미디어 아일릿 펠렛을 resuspend 50 ML 원뿔 튜브와 같은 분수에 배포할 수 있습니다. (옵션 :. 세탁 개선하기 위해 추가적인 원뿔 튜브로 배포) 1,000 rpm으로 원심 분리기, 5 분 4 ° C. </li><li> 뜨는 취소 부드럽게 흔들어 수동으로 알약을 푸세요. </li></ol> 6. Ficoll 기울기에 정제 <ol><li> 1.125 g / ML, 산도 7.4의 밀도에 Ficoll 미디어 펠렛을 Resuspend 천천히 1.080, 1.060 및 1.037 g / ML의 밀도와 Ficoll 미디어 10 ML aliquots를 오버레이. </li><li> 20 분 4 ° C, 2400 RPM에서 Ficoll 그라디언트를 원심 분리기. </li></ol> 7. 아일릿 컬렉션과 문화 <ol><li> 원심 분리 후, 다른 조직 구성 요소는 그라데이션에서 파티션으로 구분할 수 있습니다. </li><li> 지방과 결합 조직으로 구성된 상위 레이어를 폐기하십시오. </li><li> 조심스럽게 1.037-1.060 g / ML 계면에서 아일릿 집계의 첫 번째 계층은 수확. 이 계층은 가장 순수 분리된 아일 레츠가 포함되어 있습니다. 효율적인 고립을 위해 별도로 분수를 수집합니다. </li><li> 1.060-1.080 g / ML 계면에서 아일릿 집계의 두 번째, 덜 순수 분수를 수집합니다. </li><li> 50 ML의 총 볼륨 각 원뿔 튜브로 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900 ML RPMI 1640)을 씻어 미디어를 추가하여 Ficoll 그라디언트를 희석. 1,000 rpm으로 원심 분리기, 5 분 4 ° C. </li><li> 흡입하여 뜨는 폐기하십시오. 펠렛은 Ficoll 기울기로 풀어 인해 수도로주의를 기울이시기 바랍니다. </li><li> 알약 WI 와시회 세척 미디어 (5.5 MM 포도당와 10 % FBS와 900ml RPMI 1640) 1000 rpm으로 원심 분리기, 4 명이 5 분 C. 아일릿 문화 매체를 사용하여 반복 </li><li> 문화 미디어에서 아일 레츠를 Resuspend 37에서 5 % CO 2 배양기에서 그들을 자리 ° C를 추가로 처리하기 전에 24~48시간하십시오. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리의 프로토콜을 사용하여, 인간 아일 레츠는 부분 pancreatectomy에서 수집한 췌장 조직으로부터 격리 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공은 몇 가지 중요한 점 중에 찍은 치료에 의존합니다. 베타 세포 생존을 유지하기 위해서는 시편이 실험실에 얼음에 신속하게 수송하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 소화 기간은 조직 섬유증과 미디어의 효소 활동의 등급에 따라 경험적으로 최적화해야합니다. 이것은 Ricordi 챔버 수동으로 적용 기계 강제의 정도에도 마찬가지입니다. 따라서 좋은 아일릿 수율을 얻기 위해, 프로토콜은 최고의 헌신적인 과학자 또는 기술적 보조에 의해 수행됩니다. 팀 이미 아일릿 격리 경험하지 않는 초기 실패 표준입니다. 우리 아일릿 격리 프로토콜과 표준 인간 아일릿 절연 방법 사이의 주요 차이점이 있습니다 : 우리가 수술 도중에 국소 빈혈의 몇 시간의 대상이 췌장 조직을 사용하지만 1), 그것은 즉시 사이트에 처리됩니다. 이것은 할당과 아일릿 격리 시설에 전달하는 동안 몇 시간 동안 허혈성 남아있는 췌장 / 아일릿 이식을위한 뇌사 기증자에서 explanted pancreata에 대비하고 있습니다. 표준 프로토콜은 췌장 덕트에 그것을 불어 넣다하는 반면, 2) 우리는 직접 췌장 조직으로 collagenase를 주입. 3) 우리는 대신 COBE 셀 프로세서를 사용하여 지속적인 Ficoll 기울기에서 아일 레츠를 수집 불연속 Ficoll 기울기를 사용하여 아일 레츠를 구분한다. 수술 표본이 너무 fibrotic 또는 아일 레츠의 적절한 숫자를 분리를위한 부족의 경우, 조직은 여전히 레이저 캡처 microdissection (LCM) 10 검색될 수 있습니다. 이것은 아일릿 격리가 실패하거나 생산량이 매우 낮은 경우에도 유전자 표현 데이터는 거의 모든 시료에서 복구할 수 있습니다. 불행하게도, LCM은 기능 연구 살아있는 세포를 생산하지 않는 그들의 금액은 proteomic 분석을 위해 일반적으로 부족합니다. 따라서 아일 레츠를 검색하기 위해 collagenase의 소화 프로토콜과 병행하여 LCM을 사용하면 수술 표본을 처리하는 가장 효과적인 방법이 될 수 있습니다. 부분 pancreatectomies에서 아일릿 고립에 대한 조직을 수집하면, 그것은 환자의 임상 기록과 신진 대사 상태를 자세히 조사하는 것이 중요합니다. 부분 pancreatectomized 환자는 유형 3C 당뇨병, 수술 6 이어지는 췌장 장애로 보조 즉, 당뇨병에 의해 영향을받을 수 있습니다. 2010 년 본학과에서 수술을 받았습니다 43 참여 환자 중 32 비 당뇨병 있었다 5 2 형 당뇨병 및 6에 의해 영향을 받았다고하는 것은 유형의 3C 당뇨병을했다. 이러한 데이터 손상 포도당 대사 및 췌장암이나 만성 췌장염 6 고통 환자의 상응하는 소수의 당뇨병 환자를 가리키는 이전 연구에 동의합니다. 그것이 췌장 수술 7 주요 증상하기 전에 적어도 한 해에 아빠가 진단을 받으 셨어면 우리는 기본 기원하는 당뇨병으로 간주. 아일릿 autoantigens에 대한 항체의 수준은 또한 당뇨병 8 잠재적인 면역 출처를 평가하는 측정해야합니다. pancreatectomy을받은 환자가 undiagnosed 당뇨병으로 고생하거나 포도당 긴거 수 있기 때문에 이외의 모든 당뇨병 환자는 이전 pancreatectomy 9 경구 포도당 내성 테스트를 제공한다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><th> 장비 </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ML serological 피펫 (CELLSTAR) </td><td> 그라 이너 바이오 - 원 </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ML serological 피펫 (CELLSTAR) </td><td> 그라 이너 바이오 - 원 </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ML serological 피펫 (CELLSTAR) </td><td> 그라 이너 바이오 - 원 </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10 ML 주사기 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ML 주사기 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 ML 주사기 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 니들 Microlance 3 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 Gx1 / 2 니들 </td><td> 브라운 </td><td> 4,658,300 </td></tr><tr><td> 27 Gx3 / 4 니들 Microlance 3 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3cm의 세포 배양 접시의 2x2 mm 그리드 </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20cm 조직 문화 요리 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6cm 쉬운 그립 페트리 접시 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ML 저장 병 </td><td> 코닝 법인 </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ML Erlenmeyer flasks </td><td> 쇼트 듀란 </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ML Erlenmeyer flasks </td><td> 쇼트 듀란 </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ML 스크류 캡 코니컬 히프 원심 분리기 튜브 </td><td> 코닝 법인 </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ML 팰컨 원뿔 관 </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ML Easyflask 비 - 대우 </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV 필터 유니트 Duropore (0,22 μm의) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> 필터 바틀 톱 진공 (PES 70mm 직경 Membran, 0,22 μm의 기공 크기, 45mm 넥 크기, 500 ML 볼륨) </td><td> 코닝 법인 </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> 밀도계 (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> 메틀러 톨레도 </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> 빠른 PES 필터 유니트 0,2 μm의 </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> 가열 코일 </td><td> BioRep 기술 병원 </td><td> HC - 02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS - R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> 펌프 일반 PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi 챔버 (600 μm의 기공 직경 금속 메쉬) </td><td> BioRep 기술 주식 회사 </td><td> 모델 50 - U - 01, 시리얼 0503-001 </td></tr><tr><td> 준비 스탠드 </td><td> BioRep 기술 주식 회사 </td><td> 50 PS - 01 </td></tr><tr><td> O - 링 </td><td> BioRep 기술 주식 회사 </td><td> 또는 - 50 - U - 01 </td></tr><tr><td> 실리콘 질화물 구슬 (9 15mm 세트) </td><td> BioRep 기술 주식 회사 </td><td> SN - 01 </td></tr><tr><td> 실리콘 튜브 </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0mm </td></tr><tr><td> 외과 포셉 </td><td> 브라운 </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> 외과 가위 (Aesculap) </td><td> 브라운 </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> 워터 욕조 200 OLS </td><td> 부여 </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> 시약 </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagenase -&gt; Liberase의 RI (100 MG) </td><td> 로체 </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+) 포도당 </td><td> 머크 </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> 머크 </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNase I (100 MG) </td><td> 로체 </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> H15 - 002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00,509 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> A15 - 101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Foetal 소 혈청 (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 piperazinyl) ethansulfons ‰ 우레 (HEPES) </td><td> 로스 </td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> 임상 약국, 병원 </td><td> - </td></tr><tr><td> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (특급) </td><td> BD (백톤, 디킨슨과 회사) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlo​​rid </td><td> Fluka </td><td> 60,132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate 무수 </td><td> JT 베이커 </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT 베이커 </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI 중간 1640 [-] D - 포도당 [+] L - 글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI 중간 1640 [+] L - 글루타민 </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> E15 - 840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> 머크 </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> 미디어 솔루션 Dithizone 솔루션 <ul><li> 10 ML DMSO 100 MG DTZ을 디졸브 40 ML PBS에 희석 </li><li> 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의) </li></ul> 효소 솔루션 <ul><li> 20 ML RPMI 1640 미디어 100 MG의 Liberase의 RI를 (보충없이) 디졸브 </li><li> (보조제없이) 1 ML RPMI 1640 미디어 100 MG DNase를 디졸브 </li><li> 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의)와 얼음에 효소를 유지 </li></ul> 와시 미디어 (1000ml/5.5mM 포도당) <ul><li> 100 ML FBS를 (열 inactivated) 디졸브 </li><li> 450 ML RPMI 1640을 (NO 포도당) 추가 </li><li> 450 ML RPMI 1640 (11 MM 포도당)을 추가 </li><li> 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의) </li></ul> 아일릿 문화 미디어 (5,5 MM / 500ml 포도당) <ul><li> 10 ML 1M HEPES (산도 7.4)을 디졸브 </li><li> 50 ML FBS 추가 </li><li> 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신을 (100x) 추가 </li><li> 2.75 ML 1 M 포도당 솔루션 추가 </li><li> 432.25 ML RPMI 1640을 (NO 포도당) 추가 </li><li> 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의) </li></ul> 유로 콜린스 솔루션 <ul><li> 4,083g의 칼륨의 hydrogenphosphate </li><li> 70,0 g 포도당 </li><li> 2천2백37g의 칼륨 염화물 </li><li> 14,80 g의 인산의 monohydrogenphosphate </li><li> 1천6백80그램 나트륨 hydrogencarbonate </li><li> 40 ML의 전해질 용액 (E 154) </li><li> 산도 7.4 </li><li> 2000 ML에 증류수를 추가 </li><li> 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의) </li></ul> Ficoll 스톡 솔루션 <ul><li> 500g Ficoll에 유로 콜린스 솔루션 1000 ML 추가 </li><li> 8.94 g의 HEPES 추가 </li><li> Ficoll가 해결 될 때까지 밤새 볶음 </li><li> 산도 7.4 </li><li> 밀도를 측정 </li></ul> Ficoll 그라디언트 <ul><li> 밀도에 따라 FBS의 금액 유로 콜린스 솔루션과 Ficoll 주식 솔루션을 계산 </li><li> 3 솔루션을 결합 및 밀도계와 밀도를 측정 </li><li> 밀도가 조정 때까지 유로 콜린스 솔루션 또는 Ficoll 주식 솔루션 추가 </li><li> 4 무균 필터 솔루션 (0.22 μm의)와 저장 ° C </li></ul>

부분 pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

2 형 당뇨병과 Langerhans 고장 1 아일 레츠의 pathogenesis에 수사가 장기 기증자 2 제 2 형 당뇨병 아일 레츠의 제한된 가용성에 의해 방해되었다. 우리가 제 2 형 당뇨병 및 다른 췌장 질환 (양성 또는 악성 췌장 종양, 만성 췌장염, 그리고 일반적인 담즙 덕트 또는 십이지장 종양)으로 인해 부분 pancreatectomy을받은 비 당뇨병 환자에서 얻은 인간의 췌장 조직에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유 . 관련이있는 모든 환자는 또한 지역 윤리위원회의 승인을했다이 연구에 그들의 동의했다. 수술 표본은 즉시 진단 목적으로 손상된 조직을 유지, 아일릿 절연을위한 부드럽고 건강한 나타나는 췌장 조직을 선택한 병리학자에게 전달했다. 우리는 1,000 명 이상의 아일 ​​레츠를 분리 발견, 우리는 췌장 조직의 최소 2g으로 시작했다. 우리 프로토콜에 또한 필수이 효소 함유 미디어를 주입하면 가시 조직을 넓히다하고 이후 표면 영역을 증가시켜 소화를 돕기 위해 그것을 말하다하는 것이었다. 인간의 췌장 조직의 대량 (&gt; 15g)을 사용할 수있는 가끔 사건을 포함하기 위해 프로토콜의 적용을 확장하기 위해, 우리는 조직을 소화 Ricordi 챔버 (50 ML)을 사용합니다. 소화하는 동안, 우리는 수동으로 조직 섬유증이 자사의 수준에 따라 표본의 다양한 강도에 Ricordi 챔버 3 흔들었다. discontinous Ficoll 기울기는 다음 acinar 조직에서 아일 레츠를 구분하는 데 사용되었다. 우리는 조직 펠렛은 homogenously 1.125 g / ML의 밀도 Ficoll 매체에 resuspended 수있을 정도로 작은되어야한다고 지적했다. 분리 후, 우리는 그들의 기능 회복을 촉진하기 위해 최소 48 H에 대한 37 5 % CO 2와 스트레스 무료 조건 (없음 흔들림이나 회전) ° C에서 아일 레츠을 배양해. 우리 프로토콜 및 향후 개선의 광범위한 응용 프로그램은 크게 2 형 당뇨병 연구를 발전, 당뇨병에서 인간 아일 레츠 다량의 적시에 수확 및 임상 일치하지 않는 당뇨병 과목을 사용 수 있습니다.

이것은 크게 크게 섬유증 및 collagenase 활동의 차이로 인해 준비 사이의 다양한 있지만, 우리의 프로토콜, 췌장 조직 g 당 500 ~ 아일 레츠의 평균이 나왔고. 그러면 그들에게 고립 후 24 시간 handpicking, 조직을 처리하는 동안 Dithizone 처음에 얼룩으로&gt; 90 % 아일릿 순도를 달성했습니다. 정화 아일 레츠의 품질을 결정하기 위해, 우리는 2 시간 정적 조건에서 25 mm까지 포도당 자극 인슐린 분비에 대한 검사. 우리는 ECIT 아일릿 절연 및 이식 센터에서 얻은 아일 레츠의 위해 인슐린 분비가 비교 발견했습니다. 부분적으로 pancreatectomized pancreata으로부터 격리 아일 레츠는 아일릿 이식, 중요한 요인으로 간주 아니었 전체 IEQ 평가를 위해 의미되지 않습니다로. 중요한 것은 우리의 방법은 우리가 2005 년과 2008 5 사이의 25 부분 pancreatectomized 환자의 기능 연구 아일 레츠를 분리 수있었습니다. 이 아일 레츠는 서양의 모래 바닥과 immunohistochemistry으로 포도당 자극 인슐린 분비와 특정 단백질 표현 분석했다. 부분적으로 pancreatecomized pancreata으로부터 격리 아일 레츠는 유전자 및 단백질 발현 프로파일, ultrastructural 모양과 비 당뇨병과 당뇨병 아일 레츠의 기능 반응을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 장기 기증자가보다 부분 pancreatectomy을받은 많은 환자가 있기 때문에, 우리 프로토콜은 충분한 샘플 데이터는 강력한 통계 분석을 위해 수집하는 허용할 수 있습니다.

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

제2형 당뇨병의 발병 기전 및 랑게르한스섬 기능 부전(islets of Langerhans malfunction)에 관한 연구는 제2형...의 제한된 가용성으로 인해 어려움을 겪어 왔습니다.

안녕하세요, 저는 Triton 기술대학교 외과 연구소의 Florian Al입니다. 안녕하세요, 저 또한 Grayston 대학 병원 외과 연구소의 Gregor Cher입니다.눈꺼풀의 생물학 및 기능에 대한 연구는 눈꺼풀 생리학과 당뇨병 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 절실히 필요합니다. 안타깝게도 비당뇨병 환자와 제2형 당뇨병 환자의 인간 눈꺼풀 조직은 얻기가 매우 어렵습니다. 다음 비디오 시퀀스에서는 부분 췌장 최적화 환자로부터 인간 눈꺼풀을 분리하는 프로토콜을 보여드리겠습니다.이렇게 확보된 아일렛(eyelets)은 기능적 분석을 위한 인 비트로(in vitro) 시스템으로 활용될 수 있습니다. 인간 아일렛의 분리를 위해서는 인간 췌장 조직의 외과적 절제가 전제되어야 합니다. 본 연구에서는 특정 췌장 병변으로 인해 췌장 부분 절제술을 받는 환자들로부터 조직을 제공받습니다.인체 췌장 조직의 공급원으로, 외과 의사가 췌장을 절개하여 부분 절제술을 시행합니다. 그 후, 절제된 췌장 조직을 얼음에 넣어 병리과로 운반합니다. 병리 전문의는 확보할 건강해 보이고 부드러운 췌장 조직의 양을 결정합니다.안구 덮개 분리를 위해서는 최소 2g의 췌장 조직이 필요합니다. 조직을 ucon 용액에 넣고 얼음에 채워 실험실로 운반합니다. 안구 덮개 분리 과정의 첫 번째 단계는 췌장 조직의 무게를 측정하는 것입니다.그 후 샘플을 10 centimeter 접시에 넣습니다. 이미 150 milliliter의 RPMI 배지가 담긴 500 milliliter 플라스크 하나와 130 milliliter의 RPMI 배지가 담긴 250 milliliter 플라스크 하나를 준비해 두었습니다. 그다지 1 milliliter의 DNAs와 20 milliliter의 collagenase가 포함된 소화 효소 용액을 250 milliliter 플라스크에 넣고, 이를 10 milliliter 주사기로 흡입합니다.세척된 췌장 조직에 효소가 포함된 배지를 주입하여 팽창시킨 후, 표면적을 넓히고 소화 과정을 촉진하기 위해 작은 조각으로 잘게 다집니다. 주입에 의한 팽창만으로는 조직 내에 효소가 적절히 분포되지 않으므로, 이 다지기 단계가 매우 중요합니다. 이와 동시에 소화 회로를 조립하였습니다.이 그림에서 보는 바와 같이, 기록 챔버 내의 흐름 방향은 챔버 하단으로 유입되어 상단으로 유출됩니다. 그 후, 남은 효소 포함 배지를 500 milliliter 플라스크에 300 milliliter 부피가 될 때까지 채운 다음 온도계를 삽입합니다. 기록 챔버에는 공극 직경이 600 micrometer인 금속 메쉬와 직경이 각각 15 millimeter인 질화규소 구슬이 들어 있습니다.췌장 조직을 챔버로 옮기고 메쉬를 삽입한 후 챔버를 닫고, 펌프를 140 milliliter per minute의 속도로 가동합니다. 회로의 온도가 37 degrees Celsius에 도달하면 소화 시간을 측정하기 시작합니다. 기록된 챔버는 조직 구성에 따라 수동으로 흔들어 줍니다.소화를 중단할 최적의 시점을 결정하기 위해 주기적으로 샘플을 채취하고, 티손(tisone) 염색을 통해 현미경 하에서 분리된 안구 구멍(eyelets)이 붉게 나타나는지 확인합니다. 안구 구멍이 주변 조직으로부터 분리된 것으로 보이면, 가열 코일을 얼음에 넣고 회로에 200 mL의 차가운 세척 배지를 첨가하여 빠르게 소화를 중단시킵니다. 그 후, 회로가 빌 때까지 샘플 튜브를 250 mL 팔콘 튜브에 삽입하여 눈꺼풀 용액을 수집합니다.다음 세척 절차는 4°C에서 1000 RPM으로 5분간 원심분리하는 단계부터 시작합니다. 다음 단계에서는 상층액을 버리고 세척액으로 침전물을 재현탁한 후, 50 mL 팔콘 튜브에 동일한 분량으로 나누어 담습니다. 세척은 4°C에서 1000 RPM으로 5분간 다시 원심분리하는 단계로 이어집니다.선택 사항으로, 팔레트의 크기에 따라 원래의 4개 외에 추가적인 팔콘 튜브에 팔레트를 분배합니다. 세척 효과를 높이기 위해 다시 한번 상층액을 제거하고, 팔레트를 부드럽게 풀어주어 눈꺼풀 부위를 주변 조직으로부터 분리합니다. 두 부분의 서로 다른 조직 밀도를 이용하여 밀도 구배 원심분리를 적용할 수 있습니다.먼저, 펠렛을 밀도가 1.125 g/mL인 분변 배지에 재현탁합니다. 균질한 재현탁이 가능하도록 펠렛의 크기가 충분히 작아야 합니다. 다음으로, 밀도가 1.081, 1.060, 1.037인 분변 배지를 각각 10 mL씩 천천히 층을 쌓아 올립니다.그 후, 4°C에서 2,400 RPM으로 20분 동안 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 이제 분획 내에서 밀도에 따라 분리된 서로 다른 성분들을 구분할 수 있습니다. 먼저, 지방과 결합 조직으로 구성된 상층액을 제거합니다.지금 수집하는 분획은 1.037 및 1.06 단계의 첫 번째 눈꺼풀 응집물 층으로, 주로 분리된 eyelets를 포함하고 있습니다. 효율적인 분리를 위해서는 각 분획을 별도로 수집하는 것이 중요합니다. 그 다음, 첫 번째 층보다 eyelets의 순도가 낮은 1.0 60과 1.0 80의 계면에서 두 번째 눈꺼풀 응집물 분획을 수집합니다.다음으로, 분변 농도 구배를 희석하기 위해 세척액을 추가하여 총 부피를 50 milliliter로 맞춘 후, 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 4 °C에서 냉각 염색으로 인해 펠렛이 매우 느슨해질 수 있으므로, 흡입 방식으로 상층액을 제거합니다. 따라서 4 °C에서 1000 RPM으로 5분 동안 안구 배양 배지를 사용하여 세척 단계를 반복해야 합니다.마지막 단계에서는 인간 안구 조직(eyelet)을 재현탁하고, 안구 조직 배양액과 배양 매체를 사용하여 배양합니다. 수집된 안구 조직을 37 °C의 인큐베이터에서 24~48시간 동안 배양합니다. 이 배양 단계가 완료되면 안구 조직은 후속 공정을 진행할 준비가 됩니다.이 프로토콜을 통해 부분 췌장 절제술 후 췌장 조직에서 인간 췌도(eyelids)를 분리할 수 있습니다. 세포 생존력을 더 잘 유지하기 위해서는 췌장 조직을 췌도 분리 시설로 신속하고 차갑게 운송하는 것이 중요합니다. 분리 팀은 소화 과정이 매우 역동적인 절차라는 점을 유념해야 합니다.소화 과정의 소요 시간은 조직 구성에 따라 크게 달라집니다. 예를 들어, 섬유화 정도와 췌장 조직 내로의 충분한 효소 주입 가능 여부가 영향을 미칩니다. 양호한 eyelid 수율을 얻기 위해서는 기록된 챔버 내의 기계적 힘과 소화 과정의 길이를 개별적으로 조정하는 것이 매우 중요합니다.

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연구

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Medicine

의학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연 (부분 II : 인간 아일 레츠의 정화 및 문화)에 대한 절차를 수정 자동화된 방법을 사용하여.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

여기에서는 가능한 교란 요인을 감소시키면서 내분비 췌장 기능을 평가하기 위한 추가 기술로 온전한 췌장이 있는 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통해 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 수행하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

온전한 췌장을 가진 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통한 포도당 자극 인슐린 분비

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 부분 췌장절제술 환자에서 인간 아일렛을 분리하는 방법을. 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 사용하여 당뇨병 및 비당뇨 환자의 아일렛을 분리하고 생존성을 유지하는 프로토콜입니다.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

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