초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개

UTMD는 초음파 표적 미세기포 파괴(ultrasound targeted microbubble destruction)의 약자입니다. UTMD는 심장 및 간과 같이 초음파 접근이 가능한 표적 장기로 치료 유전자를 포함한 생성 활성 분자를 부위 특이적으로 전달하는 데 사용될 수 있습니다. UTMD에서는 음전하를 띤 플라스미드 DNA 벡터와 같이 목적 유전자를 인코딩하는 생성 활성 분자를 지질 미세기포 조영제의 양이온 껍질에 부착하며, 이렇게 벡터가 결합된 미세기포를 정맥 내로 또는 심장의 좌심실로 직접 투여할 수 있습니다.

대형 동물의 경우, 체류 기간의 유무와 상관없이 관상동맥 카테터를 통해 전달할 수도 있습니다. 이후 순환계에서 표적 장기로의 전달은 마이크로버블의 공진 주파수에서 발생하는 음향 공동 현상을 통해 최적으로 이루어집니다. 마이크로버블의 파괴로 인해 생성된 기계적 에너지가 표적 부위 미세혈관의 내피세포 내부 또는 세포 사이에 일시적인 기공 형성을 유도하는 것으로 보입니다.

이러한 사우나 파리온 효과(sauna parion effect)의 결과로, 내피세포 내부 및 가로질러 일어나는 형질전환 효율이 증가하며, 외래 유전자 인코딩 벡터가 관심 대상인 주변 조직에 침착될 수 있습니다. 순환계에 남아 있는 혈장 DNA는 혈액 내 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해됩니다. 글루코스 인산 완충 식염수, 디올 글리세롤 3-포스파티딜콜린 및 디올 글리세롤 3를 포함하는 준비된 마이크로버블 스톡 용액의 일부 분취액을 사용합니다.

먼저 Phosphatidyl ethanolamine를 40 °C에서 15분 동안 배양합니다. 따뜻해진 마이크로버블 용액을 글리세롤과 관심 유전자의 발현 컨스트럭트를 인코딩하는 1~2 mg의 정제된 플라스마 DNA가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 최종 부피가 500 µL가 되도록 Phosphate buffered saline을 추가합니다.

그 다음 마이크로 튜브 내부의 공기를 Octa fluoro propane 가스로 교체합니다. 이후 치과용 아말감 쉐이커(dental amalgamator)에서 마이크로 튜브를 20초 동안 강하게 흔들어 줍니다. 최초 사용 전 장비 보정 단계에서는, 적절한 기계적 지수(mechanical index)와 펄스 반복률을 보장하기 위해 1 MHz UTMD 캐비테이션 트랜스듀서를 보정해야 합니다.

1 MHz 수중 트랜스듀서를 전력 증폭기를 통해 파형 발생기에 연결합니다. 트랜스듀서는 물이 가득 찬 플라스틱 용기 안에 배치하며, 전하 증폭기를 통해 오실로스코프에 연결된 하이드로폰을 정면으로 향하게 합니다. 파형의 주파수, 진폭, 버스트 주기 및 전력 증폭은 마이크로버블을 공동화(cavitate)시키는 데 최적인 듀티 사이클과 기계적 지수를 얻기 위해 모두 조정 가능합니다. 이 설정에서, 시스템은 마이크로버블 전달 및 UTMD 시 1 MHz 마이크로버블 전달 기준으로 약 1.3에 해당하는 기계적 지수로 교정되었습니다. U-T-M-D-C 57 BL 생쥐 6마리를 ketamine 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg을 IP 주사하여 마취시킵니다.

마이크로버블 전달은 심장의 좌심실에 직접 주입하거나 꼬리 정맥 캐뉼라 삽입을 통해 정맥 내로 투여하며, 직접 심장 주입법은 나중에 설명됩니다. 플라스마 DNA가 탑재된 마이크로버블 용액을 최대 100 µL까지, 초음파 시각화 하에 전방 네 번째 늑간 공간에 삽입된 30 gauge 바늘을 통해 심장의 좌심실로 주입합니다. 좌심실 주입으로 인한 마이크로버블 용액의 볼러스는 마우스 흉부의 장축 뷰(long axis view)에 고정된 VisualSonics 고주파 초음파 트랜스듀서를 사용하여 시각화합니다.

주입 직후, 표적으로 하는 장기 바로 위에 더 작은 크기의 두 번째 저주파 1.0 megahertz 트랜스듀서를 배치하여 약 5분 동안 마이크로버블 파괴를 수행합니다. 초음파는 1.0 megahertz의 펄스 반복 주파수, 약 1.3에서 1.5에 해당하는 기계적 지수(mechanical index), 그리고 20사이클당 100 milliseconds의 펄스 반복 주기로 간처에 조사하거나, 4~6회의 심장 주기마다 3프레임의 초음파 버스트가 발생하도록 마우스의 ECG에 맞춰 펄스를 게이팅할 수 있습니다. 미세 기포의 꼬리 정맥 주입법의 경우, 플라스미드를 함유한 주사기 사용 시와 동일한 방식으로 마우스를 마취합니다.

DNA 결합 마이크로버블을 27 gauge 바늘 꼬리 정맥 카테터에 연결합니다. 꼬리 정맥 카테터를 마우스 꼬리를 따라 흐르는 좌측 또는 우측 외측 정맥의 원위 1/3 지점에 삽입합니다. 마이크로버블이 담긴 주사기를 인퓨전 펌프에 장착하여, 설정된 시간 동안 균일하게 미리 설정된 부피의 용액이 자동으로 투여되도록 합니다.

UTMD의 생체 발광 분석을 통해, 컨스트럭트에 인코딩된 유전자에 따라 다양한 방법으로 UTMD 매개 플라스미드 DNA 전달 효율을 평가할 수 있습니다. 특히, 인비보(in vivo) 생체 발광 이미징은 유전자 발현의 존재 여부와 지속 기간을 모니터링할 수 있는 방법 중 하나입니다. 이는 luciferase와 같은 생체 발광 리포터 유전자를 인코딩하는 플라스미드가 형질전환된 마우스에서 가능합니다.

Enogen 생체 내 영상 시스템은 생물 발광 분석에 사용됩니다. 영상 촬영은 일반적으로 UTMD 매개 형질전환 후 첫날 모든 마우스에 대해 수행하며, 시스템을 통해 생물 발광 유전자 발현이 더 이상 시각적으로 검출되지 않을 때까지 3~4일마다 반복합니다. 생물 발광 영상 촬영을 위해 마우스에 먼저 루시퍼라제 리포터 프로브인 Lucifer를 IP 주사합니다.

그 후 마우스에 마취제를 투여합니다. 약 3분 후, Lucifer 기질의 생체 내 분포가 약 10분 동안 진행되도록 합니다. 그 다음 동물 혹은 동물들을 Xeno Gen 이미징 챔버에 넣고 전신 이미지 스캔을 수행하며, 데이터 획득 과정에서 방출되는 광자를 측정합니다. 각 이미지가 획득된 후 시스템은 Luciferase의 광화학 반응을 결정합니다.

Xeno in vivo imaging 시스템을 사용하여, 시스템 소프트웨어로 가시적인 발광 관심 영역을 측정하고 정량화합니다.