Name: 초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 초음파 타겟 마이크로버블 파괴 기술을 이용한 심장 및 간 특이적 유전자 전달 방법을. 음향 공동현상으로 전염 효율을 높여 생체 내 치료 유전자 효과를 평가합니다.

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그랜트 지원 NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, 그리고 그랜트 -에 도움이 수상 (RVS)를 AHA 국가를 포함하고 있습니다. 특별 감사는 비디오 제작과 함께 자신의 지원 거리 코스 설계 및 컨설팅 (DCDC) 그룹 dcdcgroup.org,하고 DCDC를 설립 교육 부여 번호 P336C050047 미국 이민국에 연장됩니다.

1. Microbubble 주식 준비 <ol><li> 10 PBS의 MLS는 1g의 포도당 200 MG 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylcholine 50 MG 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylethanolamine를 섞는다. </li><li> 피펫은 5 분마다 혼합, 끓는 물 목욕 20~30분의 혼합물을 가열. </li><li> 솔루션은 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. Microbubble 준비 <ol><li> 40 준비 microbubble 재고 솔루션과 부화 ° 15 분 C의 250 μl를 가져가라. </li><li> 미리 예열 microbubble 솔루션은 다음 글리세롤의 50 μl를 포함하는 1.5 ML의 microtube로 전송됩니다. </li><li> 표현이 관심의 유전자 (4mg/ml의 최적 농도로 Qiagen 내독소 무료 MegaPrep 키트, Qiagen, 제르, MD에 의해이 예제에서 정화)에 대한 건설 인코딩 플라스미드 DNA를 정화 1-2 MG. 2.4) 인산 버퍼 호수 500 μl의 최종 볼륨에 추가됩니다. 내독소 무료 Qiagen의 maxipreps은 불임을 보장하기 위해서뿐만 아니라 멸균 PBS로 사용됩니다. </li><li> microtube에있는 공기는 다음 Octafluoropropane 가스로 대체됩니다. </li><li> microtube 그 다음 20 초 동안 치과 amalgamator에 적극적으로 흥분 상태입니다. </li><li> microbubbles에 바인딩되지 않은 subnatant 포함된 잔류 DNA와 버퍼는 다음 조심스럽게 제거하고 microbubble 계층은 무소속의 DNA를 제거하기 위해 멸균 PBS로 세 번 씻어, 각 씻어주기 사이에 얼음에 위치합니다. 우리는 일반적으로 30-40%의 결합 효율을 얻을 수 있습니다. 모든 시약은 살균하고주의 오염을 최소화하기 위해 만들어졌다. </li><li> 플라스미드 DNA - 바운드 microbubbles 그런 다음 사용 때까지 서로 다른 두 시간 동안 얼음에 게재됩니다. </li><li> 혼합 및 PBS 세척 후 microtube에서 제거 subnatant는 사용 260nm의 파장에서이 솔루션의 광학 밀도를 측정하여 언바운드 DNA의 농도와 마찬가지로 알려진 초기 농도에 따라 바운드 금액을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 분광 광도계. </li></ol> 3. 장비 보정 <ol><li> 처음 사용하기 전에, 1 MHz의 캐비테이션 변환기는 적절한 기계 색인 및 펄스 반복 수 있도록 조정해야합니다. submergible 1 MHz 이상, 13mm, 산만 변환기는 전력 증폭기를 통해 20 MHz의 기능 / 임의 파형 발생기에 연결됩니다. </li><li> 변환기는 무료 증폭기를 통해 500 MHz의 오실로 스코프에 연결되었습니다 수중 처음기에서 직접 겨냥한 물로 가득 찬 플라스틱 용기에 배치됩니다. </li><li> 파형, 주파수, 진폭, 버스트주기 및 전원 증폭은 모든 적절한 듀티 사이클 및 microbubbles을 cavitate하기 위해 최적의 기계적 인덱스를 얻기 위해 수정할 수 있습니다. 이 특정 실험을 위해, 우리는 1 MHz 이상에서 ~ 1.3에 상응하는 기계 색인 시스템을 보정합니다. </li></ol> 4. Microbubble 배송 &amp; UTMD <ol><li> 이전 microbubble 전달 및 UTMD에, C57BL / 6 마​​우스는 IP 분사를 통해 마취제와 5mg/kg xylazine을 100mg/kg로 anesthetized되었습니다. </li><li> Microbubble 배달은 심장의 좌심실로 또는 꼬리 정맥 catheterization 통해 직접 분사를 통해 정맥 투여했다. 직접 심장 주사, 최대 플라스미드 DNA - 로드된 microbubble 솔루션을 100 μl에 볼륨이 심장의 좌심실에 초음파 시각화 아래 앞쪽에 4 번째 늑간 공간에서 삽입 30 게이지 바늘을 통해 주입합니다. </li><li> 왼쪽 interventricular 주입으로 인한 microbubble 솔루션 볼러스은 Vevo 2100 이미징 시스템 비주얼 Sonics 'VisualSonics 사용하여 긴 축에보기에서 마우스의 흉부에 고정 위치에 배치 38 MHz의 고주파 초음파 변환기'를 사용하여 시각입니다. 모든 주사기와 바늘이 주사 가능한 가장 멸균 환경을 할려고, 멸균 수 있습니다. </li><li> 즉시 주사 다음, microbubble 파괴는 두 번째, 작은 크기의 낮은 주파수 1.0 MHz의 변환기를 사용하여 ~ 5 분이 지역에 파괴를 대상으로, 원하는 기관을 통해 직접적인 개최를 위해 수행됩니다. 이 예제에서는 초음파는 기계 약 1.3-1.5 색인에 상응하고, 매 20 사이클 100 MS의 펄스 반복 기간, 1.0 MHz의의 펄스 반복 주파수에서 간장을 실시했다. 또는 펄스 초음파 3 프레임마다 4-6 심장 사이클의 버스트에 (이 실험에 표시되지 않음) 마우스의 ECG에 문이 수 있습니다. 우리는 초음파의 파열 사이의 거품과 함께 리필에 모세관 침대를 허용 프로토콜과 transfection의 효율성을 구하십시오. </li></ol> 5. 대체 납품 방법 우리는 절차의 복잡으로 인해 interventricular 주사를 강조하기 위해 선택하지만, 이러한 microbubbles의 장기간 주입에 꼬리 정맥으로 많은 경우에jection이 선호하는 방법입니다. microbubble 배달의 꼬리 - 정맥 방법은 마우스 동일한 방법 anesthetized 수 있습니다. 플라스미드 DNA - 바운드 microbubbles를 포함하는 주사기는 27 게이지 바늘 / 꼬리 정맥 카테터에 연결됩니다. 꼬리 정맥 카테터는 그 마우스의 꼬리를 따라하거나 오른쪽 또는 왼쪽 측면 정맥의 말초 세번째에 삽입됩니다. microbubbles를 포함하는 주사기는 자동으로 시간이 미리 설정된 기간 동안 솔루션의 유니폼을 미리 볼륨을 관리 주입 펌프에 배치됩니다. 우리는 일반적으로 3ml/hour의 속도로 200 300μl를 달이다. 동물을 사용 모든 동물은 관련 국가 및 / 또는 현지 동물 복지 기관에 의해 정의된 좋은 동물 관행에 따라 처리되었고, 모든 동물의 작업은 (하와이 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 번호 07-100 해당위원회에 의해 승인되었다 -3). 적절한 마취 (케타민을 / zylazine)을 사용하고 진통제 (Bupivicaine 및 Buprenorphine)이 필요하지만, 사용할 수 있었어요. 6. 대표 결과 : UTMD - 중재 플라스미드 DNA 전달의 효율성은 구성 등로 인코딩된 유전자에 따라 다양한 방법을 통해 평가하며 이에 제한되지 않음 수 있으며 생체내 이미징, B - 여자 예 생체내의 얼룩 및 / 또는 루시페라제 immunohistology. 특히, 생체내 bioluminescence 이미징의 하나가 플라스미드 인코딩 발광 생물 리포터 유전자 (루시페라제)와 transfected 생쥐에서 순차적으로 유전자 발현의 존재와 시간을 모니터할 수 있습니다. VIVO 이미징 시스템 (IVIS)에서 Xenogen는 (칼리퍼 생명 과학, 홉킨튼, MA) 발광 생물 이미징에 사용됩니다. 이미지는 일반적으로 모든 마우스 UTMD 중재 transfection 후 첫날 찍은되고 발광 생물 유전자 발현이 더 이상 시스템 (그림 1)를 통해 시각적으로 감지할 수 없습니다 때까지 모든 3-4일 반복됩​​니다. 발광 생물 이미징을 위해 마우스를 준비하려면, 마우스 먼저 프로브 D - luciferin (칼리퍼 생명 과학)와 그때 anesthetized 아르 ~ 3 분 후 루시페라제 기자의 IP 주사를 받게됩니다. D - luciferin 기판의 Biodistribution는 동물 IVIS 이미징 챔버에 배치되고 몸 전체에 이미지 검색이 촬영되기 전에 ~ 10 분 동안 진행하는 허용됩니다. 인수 동안 반딧불 루시페라제 / D - luciferin 광화학 반응에서 방출 광자는 측정됩니다. 그림 1은 UTMD 다음 간을 유사한 IVIS 발광 생물 이미징을 설명하고, 그림 2는 안티 루시페라제 차 항체 (시그마 - 알드리치)과 AlexFluor - 568 복합 이차 항체 (Invitrogen)를 사용하여 transfected 간을 epifluorescence (100X) 이미지입니다 . 그것은 UTMD 중재 간 transfection은 내피 세포뿐만 아니라 영향을 것을보고 분명하지만 hepatocyes뿐. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 심장의 Xenogen / IVIS 영상은 치료 쥐를 UTMD (A) 대조군 마우스 :.. 플라스미드 + PBS 심장 감독 UTMD 다음, (B) 트리 트먼트 마우스 : 플라스미드 + 심장 다음 Microbubbles가 UTMD 감독, 그리고 (C) 치료 마우스 : 간 다음 플라스미드 이상 Microbubbles는 UTMD 감독. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림없이 UTMD 2. 간 UTMD의 Immunohistochemistry (빨간색으로 반 루시페라제.) (A) 플라스미드 및 UTMD와 (B) 플라스미드. 공촛점 이미지 (100X), 핵은 DAPI 얼룩 푸른 있습니다.

<ol><li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li>
<li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction%3A+a+review+of+non-cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ultraschall+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li>
<li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li>
<li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li>
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<li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction%3A+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

UTMD은 유전자 전달에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다. 플랫폼 기술로 그것은 조직 특이성의 높은 수준을 원하는 것입니다 bioactive 분자의 무수한를 제공하기 위해, 많은 잠재적인 유전자 치료 전략의 결합 수 있습니다. 기술의 주요 생물 학적 한계는 transfection의 낮은 효율성이다. 또 다른 중요한 고려 사항은 현저하게 뼈 또는 공기를 개입 감소 수있는 초음파 검사로 대상 기관의 접근이다. 기술은 조직 손상을 11 증가 효율성을 제한, 대상 조직 11 기반 기술의 최적화뿐만 아니라 음향의 기본적인 이해를 필요로합니다. 그러나, 그것은 조직을 특정 transgene 표현의 효과를 평가하기 위해, 저렴한 신속하고, 반복적인 접근 방식을 제공하며, transgene 표현의 낮은 수준 도움이 될 수있는 질환에 대한 효과적인 치료를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylcholine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P - 5911 </td><td> microbubble 지질 껍질 성분 </td></tr><tr><td> 1,2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphatidylethanolamine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P - 3275 </td><td> microbubble 지질 껍질 성분 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G5400 </td><td> microbubbles을 안정 생각 </td></tr><tr><td> 생리 인산염 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P5368 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G5516 </td><td> coalescing에서 microbubbles을 방지하기 위해 믿고 </td></tr><tr><td> Octafluoropropane 가스 </td><td> AirGas </td><td> N / A </td><td> 임상 응용에 사용되는 불활성 가스 </td></tr><tr><td> VialMix 치과 amalgamator </td><td> 브리스톨 - 마이어스 Squibb </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 1 MHz 이상, 13mm, 산만 변환기 </td><td> 올림푸스 </td><td> A303S - SU </td><td></td></tr><tr><td> 20 MHz의 기능 / 임의 파형 발생기 </td><td> 애질런트 </td><td> 33220A </td><td></td></tr><tr><td> 전력 증폭기 </td><td> 크론 - 하이트 (주) </td><td> 모델 7500 </td><td></td></tr><tr><td> 수중 처음기 </td><td> 브루엘 및 Kjaer </td><td> 유형 1803 </td><td></td></tr><tr><td> 충전 앰프 </td><td> 브루엘 및 Kjaer </td><td> 유형 2634 </td><td></td></tr><tr><td> 500 MHz 이상 오실로 스코프 </td><td> 르크로이의 </td><td> 9354L </td><td></td></tr><tr><td> 34 MHz의 변환기와 VisualSonics &#39;Vevo 2100 이미징 시스템 </td><td> VisualSonics </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 반장님 꼬리 정맥 카테터 </td><td> VisualSonics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 지니 플러스 주입 펌프 </td><td> 켄트 과학 </td><td> 요정 </td><td></td></tr></tbody></table>

초음파 타겟 microbubble 파괴 기술 소개

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

이러한 관심의 유전자를 인코딩 부정 청구 플라스미드 DNA를 벡터로 UTMD, bioactive 분자에서, 지질 microbubble 대비 요원 7-9의 양이온 포탄에 추가됩니다. 생쥐에서 이러한 벡터 운반 microbubbles는 심장의 좌심실 자에게하거나 직접 관리하실 수 있습니다. 큰 동물에 그들은 또한 카테터를 통해 주입 intracoronary 수 있습니다. 순환에서 대상 기관에 대한 후속 배달 microbubbles의 공진 주파수에서 음향 캐비테이션에 의해 발생합니다. 그것은 기계적 에너지 또는 대상 지역 10 microvasculature의 내피 세포 사이의 과도 기공 형성에 microbubble 파괴 결과에 의해 생성되는 가능성이 보인다. 이 sonoporation 효과의 결과로로와 내피 세포에 걸쳐 transfection 효율이 향상되며, transgene 인코딩 벡터는 주변 조직으로 입금됩니다. 순환에 남아 플라스미드 DNA는 신속하게 추가로 이외의 sonicated 조직에 전달 가능성을 감소하고 매우 구체적인 목표 - 장기 transfection로 연결 혈액에 nucleases로 저하됩니다.

초음파 타겟 Microbubble의 파괴 (UTMD)가 같은 마음으로 간 초음파 검사에 액세스할 수 기관을 대상으로, 치료 유전자를 포함 bioactive 분자의 특정 사이트 게재를 직접하는 데 사용할 수 있습니다<sup&gt; 1-6</sup&gt;.

초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개

UTMD에서는 목적 유전자를 인코딩하는 음전하의 플라스미드 DNA 벡터와 같은 생체 활성 분자들이 지질의 양이온성 껍질에 추가됩니다...

UTMD는 초음파 표적 미세기포 파괴(ultrasound targeted microbubble destruction)의 약자입니다. UTMD는 심장 및 간과 같이 초음파 접근이 가능한 표적 장기로 치료 유전자를 포함한 생성 활성 분자를 부위 특이적으로 전달하는 데 사용될 수 있습니다. UTMD에서는 음전하를 띤 플라스미드 DNA 벡터와 같이 목적 유전자를 인코딩하는 생성 활성 분자를 지질 미세기포 조영제의 양이온 껍질에 부착하며, 이렇게 벡터가 결합된 미세기포를 정맥 내로 또는 심장의 좌심실로 직접 투여할 수 있습니다.대형 동물의 경우, 체류 기간의 유무와 상관없이 관상동맥 카테터를 통해 전달할 수도 있습니다. 이후 순환계에서 표적 장기로의 전달은 마이크로버블의 공진 주파수에서 발생하는 음향 공동 현상을 통해 최적으로 이루어집니다. 마이크로버블의 파괴로 인해 생성된 기계적 에너지가 표적 부위 미세혈관의 내피세포 내부 또는 세포 사이에 일시적인 기공 형성을 유도하는 것으로 보입니다.이러한 사우나 파리온 효과(sauna parion effect)의 결과로, 내피세포 내부 및 가로질러 일어나는 형질전환 효율이 증가하며, 외래 유전자 인코딩 벡터가 관심 대상인 주변 조직에 침착될 수 있습니다. 순환계에 남아 있는 혈장 DNA는 혈액 내 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해됩니다. 글루코스 인산 완충 식염수, 디올 글리세롤 3-포스파티딜콜린 및 디올 글리세롤 3를 포함하는 준비된 마이크로버블 스톡 용액의 일부 분취액을 사용합니다.먼저 Phosphatidyl ethanolamine를 40 °C에서 15분 동안 배양합니다. 따뜻해진 마이크로버블 용액을 글리세롤과 관심 유전자의 발현 컨스트럭트를 인코딩하는 1~2 mg의 정제된 플라스마 DNA가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 최종 부피가 500 µL가 되도록 Phosphate buffered saline을 추가합니다.그 다음 마이크로 튜브 내부의 공기를 Octa fluoro propane 가스로 교체합니다. 이후 치과용 아말감 쉐이커(dental amalgamator)에서 마이크로 튜브를 20초 동안 강하게 흔들어 줍니다. 최초 사용 전 장비 보정 단계에서는, 적절한 기계적 지수(mechanical index)와 펄스 반복률을 보장하기 위해 1 MHz UTMD 캐비테이션 트랜스듀서를 보정해야 합니다.1 MHz 수중 트랜스듀서를 전력 증폭기를 통해 파형 발생기에 연결합니다. 트랜스듀서는 물이 가득 찬 플라스틱 용기 안에 배치하며, 전하 증폭기를 통해 오실로스코프에 연결된 하이드로폰을 정면으로 향하게 합니다. 파형의 주파수, 진폭, 버스트 주기 및 전력 증폭은 마이크로버블을 공동화(cavitate)시키는 데 최적인 듀티 사이클과 기계적 지수를 얻기 위해 모두 조정 가능합니다. 이 설정에서, 시스템은 마이크로버블 전달 및 UTMD 시 1 MHz 마이크로버블 전달 기준으로 약 1.3에 해당하는 기계적 지수로 교정되었습니다. U-T-M-D-C 57 BL 생쥐 6마리를 ketamine 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg을 IP 주사하여 마취시킵니다.마이크로버블 전달은 심장의 좌심실에 직접 주입하거나 꼬리 정맥 캐뉼라 삽입을 통해 정맥 내로 투여하며, 직접 심장 주입법은 나중에 설명됩니다. 플라스마 DNA가 탑재된 마이크로버블 용액을 최대 100 µL까지, 초음파 시각화 하에 전방 네 번째 늑간 공간에 삽입된 30 gauge 바늘을 통해 심장의 좌심실로 주입합니다. 좌심실 주입으로 인한 마이크로버블 용액의 볼러스는 마우스 흉부의 장축 뷰(long axis view)에 고정된 VisualSonics 고주파 초음파 트랜스듀서를 사용하여 시각화합니다.주입 직후, 표적으로 하는 장기 바로 위에 더 작은 크기의 두 번째 저주파 1.0 megahertz 트랜스듀서를 배치하여 약 5분 동안 마이크로버블 파괴를 수행합니다. 초음파는 1.0 megahertz의 펄스 반복 주파수, 약 1.3에서 1.5에 해당하는 기계적 지수(mechanical index), 그리고 20사이클당 100 milliseconds의 펄스 반복 주기로 간처에 조사하거나, 4~6회의 심장 주기마다 3프레임의 초음파 버스트가 발생하도록 마우스의 ECG에 맞춰 펄스를 게이팅할 수 있습니다. 미세 기포의 꼬리 정맥 주입법의 경우, 플라스미드를 함유한 주사기 사용 시와 동일한 방식으로 마우스를 마취합니다.DNA 결합 마이크로버블을 27 gauge 바늘 꼬리 정맥 카테터에 연결합니다. 꼬리 정맥 카테터를 마우스 꼬리를 따라 흐르는 좌측 또는 우측 외측 정맥의 원위 1/3 지점에 삽입합니다. 마이크로버블이 담긴 주사기를 인퓨전 펌프에 장착하여, 설정된 시간 동안 균일하게 미리 설정된 부피의 용액이 자동으로 투여되도록 합니다.UTMD의 생체 발광 분석을 통해, 컨스트럭트에 인코딩된 유전자에 따라 다양한 방법으로 UTMD 매개 플라스미드 DNA 전달 효율을 평가할 수 있습니다. 특히, 인비보(in vivo) 생체 발광 이미징은 유전자 발현의 존재 여부와 지속 기간을 모니터링할 수 있는 방법 중 하나입니다. 이는 luciferase와 같은 생체 발광 리포터 유전자를 인코딩하는 플라스미드가 형질전환된 마우스에서 가능합니다.Enogen 생체 내 영상 시스템은 생물 발광 분석에 사용됩니다. 영상 촬영은 일반적으로 UTMD 매개 형질전환 후 첫날 모든 마우스에 대해 수행하며, 시스템을 통해 생물 발광 유전자 발현이 더 이상 시각적으로 검출되지 않을 때까지 3~4일마다 반복합니다. 생물 발광 영상 촬영을 위해 마우스에 먼저 루시퍼라제 리포터 프로브인 Lucifer를 IP 주사합니다.그 후 마우스에 마취제를 투여합니다. 약 3분 후, Lucifer 기질의 생체 내 분포가 약 10분 동안 진행되도록 합니다. 그 다음 동물 혹은 동물들을 Xeno Gen 이미징 챔버에 넣고 전신 이미지 스캔을 수행하며, 데이터 획득 과정에서 방출되는 광자를 측정합니다. 각 이미지가 획득된 후 시스템은 Luciferase의 광화학 반응을 결정합니다.Xeno in vivo imaging 시스템을 사용하여, 시스템 소프트웨어로 가시적인 발광 관심 영역을 측정하고 정량화합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microbubbles의 Insonation는 유망 감소 시간 평균 음향 파워에서 종양 절제의 전략뿐만 아니라 치료제의 타겟으로 전달됩니다. 현재 연구의 목적은 피하 C6 gliomas가 아닌 열 microvascular 박리 및 페이로드 전송을 극대화하기 위해 낮은 듀티 사이클 초음파 pulsing 전략과 nanocarriers을 개발하는 것입니다.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 Microbubble-매개 집중 초음파 장애는 두뇌의 비침습 타겟 약물 전달을위한 유망...

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

이 비디오는 마이크로 버블 매개 집속 초음파(FUS)를 사용하여 일시적인 개구부를 만들어 혈액뇌장벽(BBB)을 일시적으로 파괴하는 방법을 설명합니다. 이러한 일시적인 국소 BBB 개구부는 결국 더 큰 크기의 약물 분자를 뇌 실질로 직접 전달하는 데 사용될 수 있습니다.

Focus Ultrasound based microbubble mediated Blood-Brain Barrier Opening: A technique to create localized transient openings in mouse by sosoporation(초음파 기반 마이크로버블 매개 혈액-뇌 장벽 개구부: 초음파 처리에 의한 마우스의 혈액-뇌 장벽에 국부적인 일시적인 개구부를 생성하는 기술)

여기서 우리는 생활에 초음파 미세 기포 조영제, 고립 늦은 임신 단계 쥐의 배아를 주입하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관류의 매개 변수 및 조영 증강 고주파 초음파 영상을 이용한 혈관 내 배아 분자 마커의 연구를 가능하게한다.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

제시된 실험 프로토콜은 성공적인 약물 전달 및/또는 기타 생체 효과에 필요한 조건의 조사를 가능하게 하기 위한 목적으로 세포 배양 장치에서 캐비테이션 활성의 실시간 측정을 수행하는 데 사용될 수 있다.

캐비테이션 강화 치료 연구

두 기포 사이의 유착 기술을 기반으로 하는 단일 트랩 음향 기포의 모양 진동을 제어하기 위해 빠르고 신뢰할 수 있는 기술이 제안됩니다. 정상 상태의 대칭 제어 기포 모양 진동을 통해 기포 계면 부근에서 생성된 유체 흐름을 분석할 수 있습니다.

음향 부상 시스템에서 Nonspherical Bubble Oscillations에 의한 마이크로스트리밍 유도

이 프로토콜은 혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중 된 초음파 및 마이크로 버블 치료 중에 설치류 뇌의 생체 내 다광 형광 이미징에서 실시간으로 가능하게하는 수술 및 기술적 절차를 설명합니다.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

제시된 프로토콜은 그들의 활성화 기계장치 및 그들의 생체 효력을 포함하여 초음파 트리거한 약 납품 응용을 위해 디자인된 형광 표지마이크로버블의 반응을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 백서는 관련 길이및 시간대를 포착하기 위해 수행된 다양한 시험관 내 및 생체 내 현미경 기술을 다룹니다.

초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

이 프로토콜은 지질 마이크로버블의 제조와 마이크로버블 물리화학적 특성을 보존하는 정제가 없는 &gt;95% 라벨링 효율을 가진 호환 가능한 원팟 마이크로버블 방사성 라벨링 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 지질 마이크로버블 제형에 효과적이며 방사성 및/또는 형광 마이크로버블을 생성하도록 맞춤화할 수 있습니다.

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

학습하세요 초음파 타겟 마이크로버블 파괴 기술을 이용한 심장 및 간 특이적 유전자 전달 방법을. 음향 공동현상으로 전염 효율을 높여 생체 내 치료 유전자 효과를 평가합니다.

초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개

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