결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

유전자 조작의 시간적 및 공간적 해상도는 그들이 교란 수있는 생물 학적 현상의 스펙트럼을 결정합니다. 여기 temporally과 공간 개별 사용

이 방법은 시간적으로나 공간적으로 은밀한 in vivo electroporation과 제브라피쉬의 형질전환 계통의 조합이 어떻게 형질전환 유전자 발현을 위해 발달 중인 배아의 영역을 선택적으로 표적화할 수 있는지 보여줍니다. 유전자 발현 및 관심 세포 유형을 제한하기 위해 인핸서 트랩 방법에 의해 파생된 4가지 형질전환 물고기인 cal TA로 시작합니다. 이 경우, 발달 중인 특정 시기에 발달 중인 후각구는 생체 내에서 GFP 리포터 플라스미드를 전뇌의 전단부에 주입하고 DNA 전달을 용이하게 하기 위해 전기천공법을 수행하며, 생체 내 형광 이미징에 의해 얻어진 결과는 특정 시간 및 발달 과정에서 전이유전자의 정확한 국소화를 나타냅니다.

한 세포 단계에서 플라스미드를 주입하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 발현이 발달 중인 뇌의 특정 영역 내의 특정 세포 유형을 대상으로 한다는 것입니다. 매개 인핸서 트랩 방법을 통해 생성된 제브라피쉬의 형질전환 계통을 사용하여 발달 중인 뇌의 특정 영역에서 전사 인자 calt A four와 리포터 단백질 M 체리의 발현을 유도합니다. 형질전환 삽입을 위해 성체 어류 이형접합체(heterozygous)의 짝짓기를 야생형 어류와 짝짓기로 설정하여 약 50%의 형질전환 자손을 산출합니다.

이제 형질전환 배아를 100마이크로몰과 페닐 트레아로 6-8시간 동안 치료합니다. 수정 후 24-28시간에 색소 형성을 차단하고 형광 이미징을 용이하게 하기 위해 수정 후 PTU 없이 배아를 난수로 옮기고 형광 현미경을 통해 전자레인지에서 M cherry의 발현으로 형질전환 배아를 식별합니다. trica를 플러스 electroporation 완충기에 있는 낮은 융해점 aros의 0.5%solution를 준비하고, 그 후에 해결책을 평형화하십시오.

섭씨 34-37도의 인큐베이터에서 약 500마이크로리터의 농업 용액을 60mm 페트리 접시 중앙에 큰 방울로 떨어뜨립니다. 가는 집게를 사용하여 형질전환 배아에서 코리안 막을 제거합니다. 방출된 배아를 전기천공법 완충액과 0.02%trica 마취제가 포함된 페트리 접시에 2분 동안 이식합니다.

이제 6-8개의 마취된 배아를 cut Michael loader 피펫 팁을 사용하여 준비된 aros 한 방울로 옮깁니다. 배아가 모두 같은 방향을 향하고 수직 행으로 정렬되도록 배치합니다. 2-3mm의 얼음이 담긴 큰 페트리 접시를 사용하여 아로스를 굳혀 배아를 제자리에 가둡니다.

접시에 electroporation buffer와 trica를 가득 채워 용액이 응고된 aros 방울을 완전히 덮도록 합니다. 정제된 GFP 발현 플라스미드를 페놀 레드 염료로 주입할 수 있도록 준비합니다. 이제 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 미세주입 피펫을 제작하십시오.

주입 피펫에 1-2마이크로리터의 DNA 플라스미드 용액을 추가한 다음 로드 피펫을 압력 주입 시스템 피펫 홀더에 장착하고 고정합니다. 압력 펄스가 발달 중인 뇌의 앞쪽 끝을 가리키는 빨간색 DNA 용액의 POF 방출을 생성할 때까지 물에 잠긴 김 물티슈를 통해 빠르게 삽입하여 장전된 피펫을 분해합니다. 혈장 DNA 용액을 발달 중인 뇌압 주사의 심실에 주입합니다.

DNA를 장래의 후각구에 인접한 것으로 밀어 넣습니다. 전뇌실 앞쪽 끝에서 붉은 염료가 명확하게 보일 때까지 DNA를 주입합니다. DNA 확산 및 희석을 방지하기 위해 즉시 electroporation 단계를 진행하십시오.

SD nine stimulator를 설정하여 단일 5밀리초 electroporation pulse를 생성합니다. 70볼트에서. 양극이 배아의 내부 끝에 인접하게 배치되고 음극이 배아 머리의 뒤쪽에 위치하도록 전극을 배치합니다.

SD nine stimulator의 단일 티끌 스위치를 사용하여 8개의 electroporation pulses를 수동으로 시작합니다. 각 펄스를 1초씩 분리합니다. 배아가 최소 10분 동안 회복할 때까지 기다립니다.

이제 가는 집게를 사용하여 배아의 윤곽을 부드럽게 따라가면서 배아 자체와의 실제 접촉을 피하십시오. 그런 다음 배아를 아그로에서 풀어줍니다. 배아의 난자 물을 되돌려 놓고 GFP 발현을 분석할 때까지 섭씨 28도를 보관합니다.

배아를 이전과 같이 몇 분 동안 난수와 0.02% 트리카 마취제로 옮기되 더 작은 35mm 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 낮은 융점 aros의 0.5% 해결책의 큰 하락 및 계란 물 플러스 trica를 추가하십시오. 이제 cut micro loader 피펫 팁을 사용하여 이 aros 한 방울에 마취된 배아 하나를 추가합니다.

배아를 똑바로 세워 직립 현미경으로 발달 중인 뇌를 등쪽에서 쉽게 볼 수 있도록 합니다. 얼음 위에서 aros를 굳히고 절단된 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아 방향을 유지합니다. 마지막으로, 접시에 계란수와 트리카를 가득 채워 용액이 응고된 아로 방울을 완전히 덮도록 합니다.

이 예는 in vivo electroporation의 시간적 해상도와 inhancer trap 형질전환 라인에 의해 매개되는 세포 유형 특이적 발현을 결합하여 발달 중인 후각구를 표적으로 합니다. 형질전환 인핸서 트랩 라인은 수정 후 5일에 배아에서 후뇌 소뇌에서 m 체리와 종아리 A 4, 배아에서 4개의 뇌 및 후각 구의 구성적 발현을 나타냅니다. 중요한 것은 전기천공법 4일 후 GFP 발현 세포가 후각구 승모세포의 전형적인 축삭돌기를 보인다

M Cherry의 신호와 GFP의 낮은 노출에 대한 이러한 비교는 GFP를 발현하는 세포체가 실제로 짧은 헤어핀 RNA 구축물을 사용하여 후각구에 국한되어 있음을 보여줍니다. 이 절차는 또한 발달 중인 뇌의 특정 세포 유형에서 기능 상실을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.