결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

이 방법은 시간적 및 공간적으로 분리된 in vivo 전기천공법을 제브라피시 형질전환 라인과 결합하여, 발달 중인 배아의 특정 영역을 선택적으로 표적해 외래유전자를 발현시키는 방법을 보여줍니다. 먼저, 특정 유전자 발현 및 관심 세포 유형으로 제한하기 위해 인핸서 트랩(enhancer trap) 방법으로 제작된 cal TA 4 형질전환 물고기를 준비합니다. 본 사례에서는 발달 과정의 특정 시기에 발달 중인 후각구(olfactory bulb)를 대상으로 하며, GFP 리포터 플라스미드를 전뇌(forebrain)의 앞쪽 끝에 in vivo로 주입한 후 DNA 전달을 촉진하기 위해 전기천공법을 수행합니다. in vivo 형광 이미징을 통해 얻은 결과는 발달의 특정 시기와 과정에서 외래유전자가 정밀하게 국소화되었음을 보여줍니다.

이 기술이 단세포 단계에서 플라스미드를 주입하는 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 발달 중인 뇌의 특정 영역 내 특정 세포 유형을 표적으로 하여 발현시킬 수 있다는 점입니다. 매개된 인핸서 트랩(mediated enhancer trap)법으로 생성된 제브라피쉬 형질전환 라인을 사용하여, 발달 중인 뇌의 특정 영역에서 전사 인자인 calt A four와 리포터 단백질인 M cherry를 모두 발현시킵니다. 형질전환 삽입물에 대해 이형접합성(heterozygous)인 성어와 야생형(wild type) 물고기를 교배시켜 약 50%의 형질전환 자손을 얻도록 설정합니다.

이제 수정 후 6~8시간부터 100 µM의 phenyl thiourea(PTU)로 형질전환 배아를 처리합니다. 색소 형성을 차단하고 수정 후 24~28시간에 형광 이미징을 용이하게 하기 위해, 배아를 PTU가 없는 배아 배양액(egg water)으로 옮깁니다. 형광 현미경 하에서 microwave 내 mCherry 발현을 통해 형질전환 배아를 식별합니다. electroporation 완충액에 Triton X-100을 추가하고 0.5% 저융점 아가로스(low melting point agarose) 용액을 준비한 후, 해당 용액을 평형화합니다.

34~37°C 인큐베이터에서, 60mm 페트리 접시 중앙에 agro 용액 약 500 µL를 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 미세 핀셋을 사용하여 형질전환 배아에서 난막을 제거합니다. 분리된 배아를 electroporation buffer와 0.02% trica 마취제가 포함된 페트리 접시로 옮겨 2분 동안 둡니다.

이제 절단된 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 마취된 배아 6~8개를 준비된 aros 방울로 옮깁니다. 배아들이 모두 같은 방향을 향하고 수직 열로 정렬되도록 배치하십시오. 2~3 mm 두께의 얼음이 담긴 커다란 페트리 접시를 사용하여 aros를 응고시킴으로써 배아를 해당 위치에 고정합니다.

전기천공 버퍼에 trica를 추가하여 디쉬에 가득 채워, 용액이 응고된 aros 방울을 완전히 덮도록 합니다. 주입을 위해 페놀 레드 염료가 포함된 정제된 GFP 발현 플라스미드를 준비합니다. 이제 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 미세주입 피펫을 제작합니다.

1~2 µL의 DNA 플라스미드 용액을 주입 피펫에 넣은 후, 로딩된 피펫을 압력 주입 시스템의 피펫 홀더에 장착하여 고정합니다. 피펫 끝이 발달 중인 뇌의 전단(anterior end)을 향하게 한 상태에서, 젖은 킴와이프(kim wipe)에 빠르게 삽입하여 압력 펄스에 의해 붉은색 DNA 용액이 배출될 때까지 피펫 내부의 기포를 제거합니다. 압력 주입을 통해 발달 중인 뇌의 뇌실로 플라스마 DNA 용액을 주입합니다.

DNA가 예상 후각구 인접 부위로 들어가도록 합니다. 전뇌 뇌실의 전단에서 붉은 색소가 명확하게 보일 때까지 DNA를 주입하십시오. DNA의 확산과 희석을 방지하기 위해 즉시 전기천공 단계로 진행하십시오.

SD nine 자극기를 70 V에서 5 ms의 단일 전기천공 펄스를 생성하도록 설정하십시오. 양극은 배아의 안쪽 끝에 인접하게 배치하고, 음극은 배아 머리 뒤쪽에 위치하도록 전극을 배치하십시오.

SD nine 스티뮬레이터의 단일 모트 스위치를 사용하여 8회의 전기천공 펄스를 수동으로 가합니다. 각 펄스 사이의 간격은 1초로 설정합니다. 배아가 최소 10분 동안 회복될 수 있도록 합니다.

이제 미세 핀셋을 사용하여 배아 자체에 직접 닿지 않도록 주의하며 배아의 외곽선을 따라 조심스럽게 훑어줍니다. 그런 다음 아가로스에서 배아를 분리합니다. 배아를 난수로 옮기고, GFP 발현 분석 전까지 28 °C에서 보관합니다.

이전과 같이 배아를 0.02% trica 마취제가 첨가된 난자수에 넣고 몇 분 동안 둡니다. 이때 배아는 더 작은 35mm 페트리 접시 중앙에 배치합니다. 0.5% 저융점 agarose 용액과 trica가 첨가된 난자수 한 방울을 크게 떨어뜨립니다. 이제 절단된 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 마취된 배아 하나를 이 agarose 방울 위에 올립니다.

정립 현미경으로 발달 중인 뇌의 배측 뷰를 쉽게 관찰할 수 있도록 배아를 수직으로 배치합니다. 얼음 위에서 aro를 응고시키고, 절단된 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아의 방향을 유지합니다. 마지막으로, 응고된 aro 방울이 용액으로 완전히 덮이도록 trica가 첨가된 난자수로 디쉬를 가득 채웁니다.

이 예제에서는 생체 내(in vivo) 전기천공법의 시간적 해상도와 인핸서 트랩(enhancer trap) 형질전환 라인에 의한 세포 유형 특이적 발현을 결합하여 발달 중인 후각구를 표적으로 삼습니다. 이 형질전환 인핸서 트랩 라인은 수정 후 5일 된 배아의 후뇌, 소뇌, 전뇌 및 후각구에서 m cherry와 calt A four를 지속적으로 발현합니다. 중요한 점은, 전기천공법 시행 4일 후 GFP 발현 세포들이 후각구 승모세포의 전형적인 축삭 돌기를 나타낸다는 것입니다.

M Cherry의 신호와 낮은 노출도의 GFP 신호를 비교한 결과, shRNA 제작물을 사용하여 GFP를 발현하는 세포체들이 실제로 후각구에 국소화되어 있음을 보여줍니다. 이 절차는 발달 중인 뇌의 특정 세포 유형에서 기능 상실을 유도하는 데에도 사용될 수 있습니다.