Name: 외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 외부 교류 전기 필드 자극과 고속 이미징을 활용한 외부 헤어 셀 운동성 분석 방법을. 이 기술은 전기운동성, 느린 운동성 및 굽힘 반응을 정량적으로 평가하여 달팽이관 기능과 청각 메커니즘 연구에 기여합니다.

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건강 그란츠 R01DC10146/R01DC010397 국립 연구소에 의해 지원 작품, P30 DC006276 연구 코어를 NIDCD하고, 헤리. 그 내용은 저자의 단독 책임이며 반드시 NIH 또는 헤리의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 관심에 대한 기존 또는 잠재 갈등을 선언하지 않습니다.

1. OHCs의 분리 <ol><li> 기니 돼지, 마우스 또는 포유류의 동물 모델에서 관자놀이 뼈를 수확하여이 절차를 시작합니다. </li><li> 다음, 달팽이관을 폭로하기 위해 탐문 니퍼를 사용하여 관자놀이 뼈를 열고 Leibovitz L - 15에 젖어. 뼈다귀 쉘 그대로 유지, 신중하게 뼈 초과를 제거합니다. 이 모든 포유 동물 종의 시간적 뼈를에 적용되는 일반적인 절차입니다 반면에 아주 작은 동물로부터 현세의 뼈를을 상대할 때는 기술에 사소한 변화가 필요할 수 있습니다. 오래된 동물 불라는 일반적으로 프로 시저에 추가 합병증을 소개하고, calcified입니다. </li><li> 마이크로 관찰에서 달팽이관의 꼭대기의 영역을 열고 선의 vascularis 및 # 11 메스 블레이드의 끝부분을 사용하여 나선형 인대를 제거 마이크로 지점 선택하고 고급 트위터. </li><li> 트위터를 사용하여 달팽이 modiolus에서 Corti의 오르간을 벗어, 5 분 실온에서 L - 15 1mg/ml collagenase에 넣어. </li><li> 달팽이관의 기저 전환에서 OHCs이 필요한 경우, 선택과 달팽이관의 기반을 덮고있는 뼈다귀 껍질을 제거하고, Corti의 오르간을 제거하기 전에 메스 블레이드를 사용하여 측두 골의 소용돌이를 구분한다. </li><li> 50 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 녹화 실로 Corti의 오르간을 전송합니다. 그 후 바늘을 통해 역류하여 세포를 떼어 놓다. </li></ol> 2. 실험 설정 <ol><li> 외부 교류 전기장 (EAEF) 발생기와 이미지 캡처 시스템 (그림 1) 자신의 링크 다이어그램. 제어 회로는 특별히 하우스 귀 연구소의 엔지니어링 핵심 구현되었습니다. </li><li> 실험에 사용된 실험 설정은 대체 LED 기반 조명 시스템 Axiovert 135TV 거꾸로 현미경 (자이스 혈구, 손우드, NY)로 구성되어 있습니다 (하이 파워 LED 시스템 - 36A​​D3500, 광속 기술, 캠벨, CA), 두 전자 micromanipulators (Eppendorf "Patchman", 독일), 켈러 포트에 PC 제어 울트라 고속 Photron Fastcam X 1024 PCI 카메라 (Photron 미국 주식 회사)와 trinocular 포트에 추가 일반 CCD 카메라. Fastcam 카메라는 높은 주파수 (최대 100,000 프레임)와 고해상도 (예를 들어, 1024 X 1024 1000 FPS에서 픽셀, 10,000 프레임, 18000 FPS에서 384 X 96에서 512 X 128 등)에서 이미지를 캡처할 수 있습니다. CCD 카메라가 다른 모니터에 연결되어있는 반면, 고속 카메라에서 제공하는 이미지는 직접 PC 모니터에서 관찰됩니다. 아날로그 저전력 및 높은 전력 디지털 : LED 기반 조명 시스템은 두 개의 서로 다른 모드에서 작동합니다. 모든 예비 절차 (전극의 위치, 세포 위치, 초점 등)은 저전력 아날로그 모드를 사용하여 수행됩니다. 높은 전력 조명은 카메라 셔터의 조리개에 의해 전환 후 방열을 촉진, 셔터 폐쇄에 의해 꺼져 있습니다. 또한, 동일한 PC에서 실행, 하우스 이어 연구소 공학 코어에서 개발된 만든 소프트웨어는, 고속 카메라, LED 기반 조명 시스템 및 EAEF의 방아쇠를 제어합니다. 전면 포트에 종래의 디지털 카메라는 필요에 따라 여전히 프레임 수 있습니다. (그림 2 A). </li><li> 전극 (0.8 mm의 팁 거리 두 개의 0.25 mm 지름 자세 와이어)은 전자 micromanipulators 중 하나를 사용하여 위치를 주도하고 있습니다. 전극들의 위치는 시각과 미세한 이미지를 통해 모니터링되며 이미지의 초점 평면의 변화는 전극이 실험 챔버의 바닥을 만진 것을 나타냅니다. 처음에는, 전기 분야는 외부 전극을 사용하여 보정합니다. 이 전극은 전기 분야의 "지도"를 생성, 다른 지점에서 전위를 측정합니다. 단일 절연 외부 머리카락 세포가 적용 EAEF하기 위해 세로 축 평행으로 전극의 팁 사이에 위치하는 경우, 그것은 elongating과 전기장의 동일한 주파수로 단축 이동합니다. 세포가 필드에 수직 배치하는 경우 OHC 응답 (휨)의 다른 종류의 관찰과 조사 수 있습니다. (그림 2 B) </li></ol> 3. EAEF의 자극 및 이미지 캡처 <ol><li> 네 가지 자극 프로토콜은 (그림 3) 선택됩니다 <ol><li> 지속적인 단일 주파수 (그림 3 A). 자극 모드, 주파수, 진폭 및 파도 유형이 집에서 만든 제어 소프트웨어 (빨간 동그라미)를 사용하여 선택할 수 있습니다. </li><li> bursted 단일 주파수 (그림 3 B). 버스트 사이의 파열 및 공백의 길이도 선택할 수 있습니다. </li><li> 선형 스위프 (그림 3 C). 초기 및 최종 주파수는 선택할 수 있습니다. </li><li> 멀티 자극 (그림 3 D). 단일 주파수 및 선형 지나간다는 하나의 실험에서 조합하여 사용할 수 있습니다. 해당 매개 변수를 선택한 후, 컨트롤 소프트웨어는 시스템을 구성하고 연산자에서 하나의 버튼을 클릭하여 가벼운 동기화 비디오 녹화 및 세포 자극을 시작하실 수 있습니다컴퓨터 화면. </li></ol></li><li> 이미지는 높은 주파수에서 추가 분석을 위해 AVI 형식으로 캡처됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <ol><li> 이 영화에 두 개의 분리된 바깥쪽 세포는 종축에, 그들이 병렬 또는 횡단하는 것입니다 외부 교류 전기 분야, 각각과 자극을 받고있는 길이 또는 곡률의 변화를 보여줍니다. (동영​​상 # 2). </li><li> OHCs 운동성이있는 응답 ProAnalyst 소프트웨어 (Xcitex 주식 회사, 캠브리지, MA)를 사용하여 라인을 분석하고 있습니다. 이 소프트웨어에서 "기능 추적"기능은 두 지점 프레임으로 프레임 (그림 4) 사이의 거리를 제공합니다. 그리고 세포 (기저 극, 녹색)의 기본, 꼭대기 (붉은 색 Cuticular 판)에서 선택된 지점 사이의 거리를 단축 셀 동안 작고이며, 세포 연신율과 함께 증가합니다. 영화는 프레임간에게 길이의 변화를 분석하는 소프트웨어를 보여줍니다. 이미지의 하단에있는 패널은 운동의 흔적을 보여줍니다. 이 예제에서는 길이의 전체 변화는 6.5 픽셀에 대해서입니다. </li><li> ProAnalyst 소프트웨어에서 "컨투어 추적"기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학과 (그림 5)의 영역을 측정할 수 있습니다. </li><li> 폴리스티렌 microspheres 무작위로 목욕 솔루션에 추가되고 단단히 플라즈마 막 (그림 6)에 첨부합니다. 다른 microspheres 동시에 선택할 수 있으며, 소프트웨어가 자동으로 모두 프레임으로 프레임을 추적할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 세포는 섹션에 나누어 각 섹션의 운동성 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6) </li><li> 선택하여 microspheres은 셀 이미지의 측면 가장자리에 위치하고, 각 세그먼트의 길이 변화와 하나의 세그먼트 존중의 각도 변경 (벤딩) 기타도 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. EAEF 생성기 및 이미지 캡처 시스템과 함께 해당 링크 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 실험 설정의 그림 2.) 그림. 전극과 하나의 OHC 전기 필드의 세로 축 병렬로 그들 사이에 위치를 묘사 만화로 현미경 단계의 B) 세부. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 단일 주파수 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 선택한 매개 변수는 빨간색으로 동그라미 있습니다. B) 집에서 만든 제어 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 버스트 단일 주파수 자극에 대한 구성. 선형 스위프 자극에 대해 구성된 집에서 만든 제어 소프트웨어의 C) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 멀티 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의 D) 사용자 인터페이스를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 기본 (녹색)과 ProAnalyst 소프트웨어의 '기능 추적 "기능을 이용하여 각각의 셀,의 꼭대기 (적색)에서 선택한 두 지점과 OHC의 싱글 프레임. 세포 아래의 곡선은 전기 자극과 관련된 선택된 지점 사이의 거리에있는 정기적인 변화를 보여줍니다. 수직 막대 다른 프레임을 이동하는 것은 개별적인 분석을 위해 선택할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. ProAnalyst의 "컨투어 추적"기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학 부분의 영역을 측정합니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 폴리스티렌 microspheres (위) 및 microspheres 개별적으로 (아래)을 선택 5가 동일한 이미지로 장식된 격리 OHC의) 캡처한 이미지. 다른 색상은 각 microsphere에 할당되었고, 그들의 변위는 개별적으로 자동으로 프레임에서 추적 프레임 수, 분석 및 비교. B) 임의의 길이의 세그먼트 microspheres은 세포의 가장자리에 위치한 폴리스티렌을 선택하여 정의될 수 있으며,이 세그먼트의 길이의 변화뿐만 아니라 다른 하나의 세그먼트 존중의 방향 변경 (세포 굽힘) 자동으로 프레임을 평가할 수 이미지 분석 소프트웨어 프레임. 영화 1. 실험용 돼지 OHCs의 격리가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 2. 전형적인 electromotility과 굽힘 반응을 보여주는 EAEF에 OHCs의 평행과 수직이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
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<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 실험 방법은 세포의 움직임에 어떤 제한없이 kHz에서 범위에서 OHC 운동성이있는 응답을 추정 수 있습니다. 다른 자극 프로토콜, 추가적인 마커 (microspheres)은 전기장에 대하여 세포의 방향에 잘 변화로, 그것이 가능한 이전에 액세스할 세부 수준 OHC의 운동성의 새로운 측면을 조사합니다. 다른 방법은, 예를 들어 photodiodes 9 레이저 도플러 vibrometry 10을 사용 이들은 세포의 위치를 꽉 컨트롤을 필요로합니다. 여기, 반대로 모든 측정은 동일한 세포에 속한 지점 사이에 수행하고 있으며, 모든 배기량은 세포 모양이 아닌 참조의 외부 프레임과 관련하여 자신의 운동과 변화에 연결되어 있습니다. 횡단면 OHC 지역의 안정적인 측정도 쉽게 OHC 볼륨의 빠른 변화의 추정을 허용하는, 얻을 수 있습니다. 또한,보다 빠르고 민감한 카메라와 더 나은 이미지 분석 소프트웨어의 지속적인 개발이 메서드의 품질의 지속적인 향상을 보장합니다. 기술, 플라즈마 막 전체...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Leibovitz의 L - 15 </td><td> Gibco </td><td> 21,083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (타입 4) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C5138 </td><td> L - 15 1mg/mL </td></tr></tbody></table>

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs는 Corti, 포유류의 내이 (内耳) 안에있는 청각 기관의 오르간에 위치하고 원통형 sensorimotor 세포입니다. 이름은 &quot;세포는&quot;stereocilia, 소리 에너지를 1 감지 및 전달을위한 중요한 요소들의 특징 혀끝의 번들에서 유래. OHCs 변경할 수있는 형태를 연장하다 단축하고, 벤드 -에, 전기 기계 및 화학 자극에 응답하여, 모터의 응답이 음향 신호의 증폭 달팽이 2 중요 간주됩니다. I) electromotility, 일명 빠른 운동성, 밀도 OHC 플라즈마 막의 포장 모터 단백질의 전기 구동 conformational 변화에서 파생 마이크로초 범위의 길이 변경, II) 느린 운동성,의 모양 변경 : OHC의 자극은 두 가지 운동성이있는 답변을 유도 초 밀리초는 cytoskeletal 개편 2, 3을 포함하는 범위입니다. OHC 벤딩은 측면 플라즈마 막, 또는 그 모터 단백질 (예를 들어, 세포의 긴 축에 전기 현장 직각 포함) 4 비대칭 전기 자극에서 모터 단백질의 비대칭 분포에서 중 electromotility과 관련된, 그리고 결과입니다. 기계 및 화학적 자극은 세포 및 / 또는 그들의 환경의 이온 조건의 변화 또한 플라즈마 막 - 임베디드 모터 단백질 5, 6을 자극 수 있지만, 본질적으로 느린 운동성이있는 응답을 유도. OHC 운동성이있는 응답 달팽이 앰프의 필수 요소, 음향 주파수 (대략 인간 20 Hz로 20 kHz에서에서)에서 이러한 운동성이있는 반응의 정성 및 정량 분석되기 때문에 연구 7 청각 분야에서 매우 중요한 문제입니다. 고속 videocameras, LED 기반의 조명 시스템, 정교한 이미지 분석 소프트웨어를 결합하여 새로운 이미징 기술의 개발은 이제 외부 교류 전기장 (EAEF)에 안정적인 질적 및 절연 OHCs의 운동성이있는 응답의 양적 연구를 수행할 수있는 기능을 제공합니다 8. 이것은 이전의 접근 9-11의 한계의 대부분을 circumvents 간단하고 비침습 기술입니다. 또한, LED 기반의 조명 시스템은 샘플에 사소한 열 효과를 극도의 밝기를 제공하며, 때문에 비디오 현미경의 사용, 광학 해상도는 기존의 가벼운 현미경 기술 12보다 적어도 10 배 이상이다. 예를 들어, 실험 설치가 여기서 설명과 함께 약 20 NM의 세포 길이의 변화는 일상적으로하고 안정적​​으로 10 kHz에서의 주파수에서 감지하고,이 해결 방법은 더 낮은 주파수에서 향상시킬 수 있습니다. 우리는이 실험 접근 OHC의 운동성를 기본 세포와 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이됩니다 확신하고 있습니다.

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외유모세포(OHCs)는 포유류 내이의 청각 기관인 코르티 기관(Organ of Corti)에 위치한 원통형의 감각운동 세포입니다. "유모세포"라는 명칭은 ...

본 절차의 전반적인 목적은 전기 운동성, 완속 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡을 포함하여 외유모세포(outer hair cell, OHC)의 운동 반응을 조사하는 신뢰할 수 있는 방법을 소개하는 것입니다. 이는 먼저 기니피그, 마우스 또는 기타 포유류 동물에서 측두골을 채취하고, bulla를 열어 와우를 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 와우를 Lebovits L 15에 담근 후, 골성 외피의 정단 부위, 나선 인대 및 stria vascularis를 제거하고 Corti 기관을 분리하는 것입니다.Cort 기관을 1 mg/mL collagenase에서 5분 동안 배양한 후, 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 기록 챔버로 옮기고, 바늘을 통해 역류시켜 세포를 분리합니다. 그 다음 기록 챔버를 현미경으로 이동시켜 외부 교류 전기장으로 세포를 자극하고, 고속 카메라를 이용해 분리된 외모세포의 운동 반응을 비디오로 기록합니다. 최종적으로 컴퓨터 보조 이미지 분석을 통해 외모세포, 전기 운동성, 완만 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡 현상을 평가할 수 있습니다.기니피그, 마우스 또는 기타 포유류 동물 모델로부터 측두골을 채취하여 이 절차를 시작합니다. 그다음, nipper를 사용하여 측두골을 엽니다. 달팽이관을 노출시키기 위해 과잉 골조직을 조심스럽게 제거하되, 달팽이관의 골성 외벽(bony shell)이 손상되지 않도록 유지하며 livi L 15에 침전시킵니다.현미경 하에서 와우의 정단부를 개방합니다. 메스 날 끝, 마이크로 포인트 픽 또는 정밀 핀셋을 사용하여 건조기, VASIs 및 나선 인대를 제거합니다. 핀셋으로 와우 Modius에서 코르티 기관을 제거합니다.다음으로 달팽이관을 1 mg/mL collagenase에 넣고 상온에서 5분 동안 둡니다. 달팽이관 기저 회전부의 유모세포가 필요한 경우, 픽(pick)을 사용하여 달팽이관 기저부를 덮고 있는 골성 외피를 제거하고 메스 날을 사용하여 와우관을 측두골로부터 분리합니다. 코르티 기관을 제거하기 전, 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 코르티 기관을 기록 챔버로 옮깁니다. 그 후 바늘을 통해 세포를 리플럭스(refluxing)하여 세포를 해리시킵니다.외부 교번 전기장 발생 장치와 House Ear Institute 공학 코어에서 특별히 구현한 이미지 캡처 시스템, 제어 회로 및 소프트웨어 간의 연결 관계를 나타낸 도식입니다. 본 실험에 사용된 실험 장치는 LED 기반 조명 시스템과 두 개의 전자 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 Axia vert 1 3 5 TV 도립 현미경으로 구성됩니다. 현미경에는 세 개의 카메라 보고 장치가 있으며, 텔레포트에 장착된 PC 제어 초고속 photron fast cam X 10 24 PCI 카메라는 고해상도로 최대 100,000 FPS의 고주파수 이미지 캡처가 가능합니다.고속 카메라에서 제공하는 영상은 PC 모니터에서 직접 관찰합니다. 접안 포트에 있는 별도의 일반 CCD 카메라는 고해상도 모니터에 연결되어 있습니다. 전면 포트의 일반 디지털 사진 카메라는 정지 프레임 캡처를 가능하게 하며, 동일한 PC에서 실행되는 자체 제작 소프트웨어가 고속 카메라, 조명 시스템 및 외부 교류 전장 마운트의 트리거를 제어합니다.전기 미세 조작기(electric micro manipulator) 상에 팁 간 거리 0.8 mm의 직경 0.25 mm 은선 두 개로 구성된 두 개의 전극이 있습니다. 다음으로, 외부 전극을 사용하여 전기장을 보정합니다. 이 전극은 서로 다른 지점의 전위를 측정하여 전기장 지도를 생성합니다.단일로 분리된 외유모세포를 전극 팁 사이에 배치하고 그 종축을 인가된 교류 전기장과 평행하게 두면, 세포는 전기장과 동일한 주파수로 신장과 수축을 반복하며 움직입니다. 예를 들어, 여기서는 50 hertz로 자극을 주고 초당 1000 프레임으로 기록한 세포의 모습이 나타나 있습니다. 다음 영상은 4 kilohertz로 자극을 주고 초당 18,000 프레임으로 기록한 세포의 모습입니다.세포를 전계에 수직으로 배치하면, 외유모세포의 서로 다른 유형의 굴절 반응을 관찰하고 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 이 세포는 장축에 수직인 전기장으로 50 hertz에서 자극을 받을 때 굴절됩니다. 외유모세포는 비전기적 자극에 반응하여 형태 변화를 보일 수 있습니다.이러한 반응을 서행성 운동(slow motility)이라고 하며, 본 기술을 통해 조사할 수 있습니다. 네 가지 서로 다른 프로토콜 중에서 각기 다른 자극을 선택하십시오. 첫 번째는 연속 단일 주파수 자극입니다.자체 제작한 제어 소프트웨어를 통해 빨간색 원으로 표시된 자극 모드, 주파수, 진폭 및 파형을 선택할 수 있음에 유의하십시오. 두 번째 자극 프로토콜은 버스트 단일 주파수(bursted single frequency) 방식으로, 버스트의 길이와 버스트 간 간격을 조절할 수 있습니다. 세 번째는 리니어 스윕(linear sweep) 방식으로, 시작 주파수와 최종 주파수를 조절할 수 있습니다.네 번째 자극 프로토콜은 다중 자극으로, 서로 다른 자극 모드의 조합이 가능합니다. 해당 파라미터를 선택하면 제어 소프트웨어가 시스템을 설정하며, 운영자는 컴퓨터 화면의 버튼 하나를 클릭하여 빛과 동기화된 비디오 녹화 및 세포 자극을 시작할 수 있습니다. 이 영상에서는 분리된 외유모세포가 각각 종축에 평행하거나 수직인 외부 교류 전기장으로 자극을 받을 때 길이 또는 곡률이 변하는 모습을 보여줍니다.외유모세포의 반응은 Pro Analysts 소프트웨어의 특징 추적 기능을 사용하여 오프라인으로 분석합니다. 여기에서 보여주는 것은 50 Hz의 주파수로 자극을 주고 초당 1000 프레임으로 기록한 외유모세포입니다. 소프트웨어는 세포 수축 시에 보여지는 것처럼 두 지점 사이의 거리를 프레임별로 제공합니다. 빨간색으로 표시된 큐티클 판(cuticular plate)인 정점과 초록색으로 표시된 기저극(basal pole)인 세포 기저부에서 선택한 지점 사이의 거리는 더 짧으며, 세포가 신장됨에 따라 거리가 증가합니다. 소프트웨어는 외유모세포 길이 변화에 대해 프레임별 분석을 수행합니다.이미지 하단의 패널은 이동 경로의 흔적을 보여줍니다. 이 예시에서 총 변화 길이는 약 6.5 pixels입니다. 여기서는 pro analys 소프트웨어의 윤곽 추적 기능을 통해 세포 가장자리를 감지하고 광학 절편의 면적을 자동으로 측정할 수 있음을 보여주는 예시입니다.본 실험에서는 폴리스티렌 미세구체(polystyrene microspheres)를 배스 용액에 무작위로 첨가하여 세포막에 견고하게 부착시킵니다. 서로 다른 미세구체들을 동시에 선택할 수 있으며, 소프트웨어를 통해 모든 미세구체를 프레임별로 자동 추적할 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포를 여러 구역으로 나누고, 각 구역의 운동성을 독립적으로 평가할 수 있습니다.세포의 측면 가장자리에 위치한 미세구체들을 선택함으로써, 각 세그먼트의 길이 변화와 한 세그먼트의 다른 세그먼트에 대한 각도 변화를 독립적으로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.물론, 녹화된 영상의 오프라인 분석을 위해서는 추가 시간이 필요합니다. 하지만 적절한 소프트웨어를 사용하면 영상당 약 3시간 정도의 추가 시간 내에 분석을 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전기 운동성, 서행 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡을 포함하여 외유모세포의 운동 반응을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

이 비디오는 쥐귓바퀴의 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합된 기록을 보여줍니다. 형광성 염료에 노출되기 전과 후에 모낭 신경 말단의 기계적 자극, 생성된 활동 전위의 전기 생리학 기록, 모낭의 신경 말단 라벨링의 시각화와 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles(쥐 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합 기록)

출처: Lukasz, D., et al. 유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포의 생체 내 칼슘 이미징. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 마비된 형질전환 제브라피쉬 유충의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 유입의 실시간 이미징을 보여줍니다. 유체 펄스를 통한 모발 다발의 기계적 자극은 기계적 전달 채널과 전압 개폐 채널을 통해 칼슘 유입을 유도하며, 이는 형광 지시약을 사용하여 실시간으로 시각화됩니다. 이 방법은 신경비만 유모 세포의 정점 및 기저 칼슘 역학을 강조하여 물 이동 감지에서의 역할을 밝힙니다.

유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 역학 이미징

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

쥐, 귀, 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말끝의 피침형 말단의 기계적 자극으로 인한 구심성 방전을 기록하는 간단하고 새로운 기술이 제시됩니다.

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

여기에서는 스티릴 피리디늄 염료로 염색 및 탈색하는 동안 마우스, 귀 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말뚝 말단의 살아있는 피침형 감각 말단을 이미징하기 위한 새로운 준비에 대해 설명합니다.

의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 귀 피부

미국 황소 개구리의 (모이 catesbeiana) sacculus 머리 세포 생리학의 직접 검사를 허용합니다. 여기에 해부 및 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비를 설명한다. 우리는 자발적인 운동의 번들의 힘 - 변위 관계의 계산과 측정을 포함하여이 유모 세포에서 대표적인 실험을 보여줍니다.

미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em&gt; 모이 catesbeiana</em&gt;)

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

배우세요 외부 교류 전기 필드 자극과 고속 이미징을 활용한 외부 헤어 셀 운동성 분석 방법을. 이 기술은 전기운동성, 느린 운동성 및 굽힘 반응을 정량적으로 평가하여 달팽이관 기능과 청각 메커니즘 연구에 기여합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

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