외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

본 절차의 전반적인 목적은 전기 운동성, 완속 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡을 포함하여 외유모세포(outer hair cell, OHC)의 운동 반응을 조사하는 신뢰할 수 있는 방법을 소개하는 것입니다. 이는 먼저 기니피그, 마우스 또는 기타 포유류 동물에서 측두골을 채취하고, bulla를 열어 와우를 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 와우를 Lebovits L 15에 담근 후, 골성 외피의 정단 부위, 나선 인대 및 stria vascularis를 제거하고 Corti 기관을 분리하는 것입니다.

Cort 기관을 1 mg/mL collagenase에서 5분 동안 배양한 후, 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 기록 챔버로 옮기고, 바늘을 통해 역류시켜 세포를 분리합니다. 그 다음 기록 챔버를 현미경으로 이동시켜 외부 교류 전기장으로 세포를 자극하고, 고속 카메라를 이용해 분리된 외모세포의 운동 반응을 비디오로 기록합니다. 최종적으로 컴퓨터 보조 이미지 분석을 통해 외모세포, 전기 운동성, 완만 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡 현상을 평가할 수 있습니다.

기니피그, 마우스 또는 기타 포유류 동물 모델로부터 측두골을 채취하여 이 절차를 시작합니다. 그다음, nipper를 사용하여 측두골을 엽니다. 달팽이관을 노출시키기 위해 과잉 골조직을 조심스럽게 제거하되, 달팽이관의 골성 외벽(bony shell)이 손상되지 않도록 유지하며 livi L 15에 침전시킵니다.

현미경 하에서 와우의 정단부를 개방합니다. 메스 날 끝, 마이크로 포인트 픽 또는 정밀 핀셋을 사용하여 건조기, VASIs 및 나선 인대를 제거합니다. 핀셋으로 와우 Modius에서 코르티 기관을 제거합니다.

다음으로 달팽이관을 1 mg/mL collagenase에 넣고 상온에서 5분 동안 둡니다. 달팽이관 기저 회전부의 유모세포가 필요한 경우, 픽(pick)을 사용하여 달팽이관 기저부를 덮고 있는 골성 외피를 제거하고 메스 날을 사용하여 와우관을 측두골로부터 분리합니다. 코르티 기관을 제거하기 전, 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 코르티 기관을 기록 챔버로 옮깁니다. 그 후 바늘을 통해 세포를 리플럭스(refluxing)하여 세포를 해리시킵니다.

외부 교번 전기장 발생 장치와 House Ear Institute 공학 코어에서 특별히 구현한 이미지 캡처 시스템, 제어 회로 및 소프트웨어 간의 연결 관계를 나타낸 도식입니다. 본 실험에 사용된 실험 장치는 LED 기반 조명 시스템과 두 개의 전자 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 Axia vert 1 3 5 TV 도립 현미경으로 구성됩니다. 현미경에는 세 개의 카메라 보고 장치가 있으며, 텔레포트에 장착된 PC 제어 초고속 photron fast cam X 10 24 PCI 카메라는 고해상도로 최대 100,000 FPS의 고주파수 이미지 캡처가 가능합니다.

고속 카메라에서 제공하는 영상은 PC 모니터에서 직접 관찰합니다. 접안 포트에 있는 별도의 일반 CCD 카메라는 고해상도 모니터에 연결되어 있습니다. 전면 포트의 일반 디지털 사진 카메라는 정지 프레임 캡처를 가능하게 하며, 동일한 PC에서 실행되는 자체 제작 소프트웨어가 고속 카메라, 조명 시스템 및 외부 교류 전장 마운트의 트리거를 제어합니다.

전기 미세 조작기(electric micro manipulator) 상에 팁 간 거리 0.8 mm의 직경 0.25 mm 은선 두 개로 구성된 두 개의 전극이 있습니다. 다음으로, 외부 전극을 사용하여 전기장을 보정합니다. 이 전극은 서로 다른 지점의 전위를 측정하여 전기장 지도를 생성합니다.

단일로 분리된 외유모세포를 전극 팁 사이에 배치하고 그 종축을 인가된 교류 전기장과 평행하게 두면, 세포는 전기장과 동일한 주파수로 신장과 수축을 반복하며 움직입니다. 예를 들어, 여기서는 50 hertz로 자극을 주고 초당 1000 프레임으로 기록한 세포의 모습이 나타나 있습니다. 다음 영상은 4 kilohertz로 자극을 주고 초당 18,000 프레임으로 기록한 세포의 모습입니다.

세포를 전계에 수직으로 배치하면, 외유모세포의 서로 다른 유형의 굴절 반응을 관찰하고 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 이 세포는 장축에 수직인 전기장으로 50 hertz에서 자극을 받을 때 굴절됩니다. 외유모세포는 비전기적 자극에 반응하여 형태 변화를 보일 수 있습니다.

이러한 반응을 서행성 운동(slow motility)이라고 하며, 본 기술을 통해 조사할 수 있습니다. 네 가지 서로 다른 프로토콜 중에서 각기 다른 자극을 선택하십시오. 첫 번째는 연속 단일 주파수 자극입니다.

자체 제작한 제어 소프트웨어를 통해 빨간색 원으로 표시된 자극 모드, 주파수, 진폭 및 파형을 선택할 수 있음에 유의하십시오. 두 번째 자극 프로토콜은 버스트 단일 주파수(bursted single frequency) 방식으로, 버스트의 길이와 버스트 간 간격을 조절할 수 있습니다. 세 번째는 리니어 스윕(linear sweep) 방식으로, 시작 주파수와 최종 주파수를 조절할 수 있습니다.

네 번째 자극 프로토콜은 다중 자극으로, 서로 다른 자극 모드의 조합이 가능합니다. 해당 파라미터를 선택하면 제어 소프트웨어가 시스템을 설정하며, 운영자는 컴퓨터 화면의 버튼 하나를 클릭하여 빛과 동기화된 비디오 녹화 및 세포 자극을 시작할 수 있습니다. 이 영상에서는 분리된 외유모세포가 각각 종축에 평행하거나 수직인 외부 교류 전기장으로 자극을 받을 때 길이 또는 곡률이 변하는 모습을 보여줍니다.

외유모세포의 반응은 Pro Analysts 소프트웨어의 특징 추적 기능을 사용하여 오프라인으로 분석합니다. 여기에서 보여주는 것은 50 Hz의 주파수로 자극을 주고 초당 1000 프레임으로 기록한 외유모세포입니다. 소프트웨어는 세포 수축 시에 보여지는 것처럼 두 지점 사이의 거리를 프레임별로 제공합니다. 빨간색으로 표시된 큐티클 판(cuticular plate)인 정점과 초록색으로 표시된 기저극(basal pole)인 세포 기저부에서 선택한 지점 사이의 거리는 더 짧으며, 세포가 신장됨에 따라 거리가 증가합니다. 소프트웨어는 외유모세포 길이 변화에 대해 프레임별 분석을 수행합니다.

이미지 하단의 패널은 이동 경로의 흔적을 보여줍니다. 이 예시에서 총 변화 길이는 약 6.5 pixels입니다. 여기서는 pro analys 소프트웨어의 윤곽 추적 기능을 통해 세포 가장자리를 감지하고 광학 절편의 면적을 자동으로 측정할 수 있음을 보여주는 예시입니다.

본 실험에서는 폴리스티렌 미세구체(polystyrene microspheres)를 배스 용액에 무작위로 첨가하여 세포막에 견고하게 부착시킵니다. 서로 다른 미세구체들을 동시에 선택할 수 있으며, 소프트웨어를 통해 모든 미세구체를 프레임별로 자동 추적할 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포를 여러 구역으로 나누고, 각 구역의 운동성을 독립적으로 평가할 수 있습니다.

세포의 측면 가장자리에 위치한 미세구체들을 선택함으로써, 각 세그먼트의 길이 변화와 한 세그먼트의 다른 세그먼트에 대한 각도 변화를 독립적으로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

물론, 녹화된 영상의 오프라인 분석을 위해서는 추가 시간이 필요합니다. 하지만 적절한 소프트웨어를 사용하면 영상당 약 3시간 정도의 추가 시간 내에 분석을 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전기 운동성, 서행 운동성 및 음향 주파수에서의 굴곡을 포함하여 외유모세포의 운동 반응을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.