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세포의 발전소로 알려진 세포질 소기관인 미토콘드리아는 암이 진행되는 동안 급격한 구조적, 기능적 변화를 겪습니다.
미토콘드리아를 분리하려면 깨끗한 암 조직을 유리 접시에 담아 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 미토콘드리아 분리 완충액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 샘플을 균질화하여 세포를 파괴하고 소기관을 포함한 내용물을 방출합니다.
혼합물을 저속으로 원심분리합니다. 이것은 핵, 조직 파편 및 온전한 세포와 같은 밀도가 높은 구성 요소를 펠릿화하여 상청액에 미토콘드리아, 마이크로솜, 퍼옥시좀 및 리소좀과 같은 밀도가 낮은 구성 요소를 남깁니다. 상층액을 수집하고 고속으로 원심분리합니다. 상대적으로 가벼운 마이크로솜은 상청액에 남아 있는 반면, 조미토콘드리아 함유 분획은 바닥에서 펠릿화됩니다.
상청액을 제거하고 펠릿을 적절한 밀도 구배 배지에 재현탁합니다. 서로 다른 밀도 매체 내에 조미토콘드리아 분획을 적층하여 밀도가 아래에서 위로 내림차순으로 배열하여 불연속적인 밀도 구배를 설정합니다. 매우 빠른 속도로 원심분리합니다. 소기관은 상대 밀도에 따라 평형 위치를 채택하기 위해 튜브 내에서 분리됩니다. 퍼옥시좀과 리소좀을 포함하는 밀도 매체 사이의 계면에 형성된 미토콘드리아 분획을 수집합니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 250밀리리터의 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다. 깨끗한 유리 접시에 약 1.5g의 난소암 조직을 넣습니다. 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충액 2밀리리터를 첨가하여 조직 표면에서 혈액을 가볍게 씻어냅니다. 이 세탁을 세 번 반복합니다.
그런 다음 깨끗한 안과용 가위를 사용하여 조직을 약 1입방밀리미터 조각으로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 밀리리터당 0.2밀리그램의 농도로 나가르스를 함유하는 미토콘드리아 분리 완충액 13.5밀리리터를 첨가한다. 전기 균질화기를 사용하여 다진 조직을 섭씨 4도에서 2분 동안 균질화합니다.
그런 다음 조직 균질체에 미토콘드리아 분리 완충액 3밀리리터를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 준비된 조직 균질액을 1,300 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 제거하고 상청액을 유지합니다.
다음으로, 상청액을 10,000 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 마이크로솜 함유 상청액을 제거하고 펠릿을 유지합니다. 미토콘드리아 분리 완충액 2밀리리터를 추가하고 가벼운 피펫팅으로 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
이 펠릿 현탁액을 섭씨 4도 7,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 조미토콘드리아가 포함된 펠릿을 보관합니다. 추출된 조미토콘드리아를 재현탁하기 위해 25% 밀도 구배 배지 12밀리리터를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재현탁된 조미토콘드리아를 포함하는 불연속 밀도 구배를 만들고 52,000 x g 및 섭씨 4도에서 90분 동안 원심분리합니다.
길고 뭉툭한 주사기를 사용하여 25%와 30% 그래디언트 배지 사이의 경계면에서 정제된 미토콘드리아를 수집하고 이를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 첨가하여 3배 부피로 희석합니다. 15,000 x g 및 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 보관하십시오. 정제된 미토콘드리아가 포함된 최종 펠릿을 모아 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.