근위 배양 시스템: 세포 간의 부분비 신호 전달을 연구하기 위한 체외 배양 기술

측분비 신호 전달에서 세포는 인접 세포에서 반응을 유도하는 신호 분자를 생성하고 분비합니다. 측분비 신호 전달을 모방하려면 난소암 세포와 중피 세포의 단일 세포 현탁액을 적절한 배지에서 준비하는 것부터 시작합니다.

다음으로, 멸균 배양 접시에 거꾸로 된 다공성 막 삽입물을 취합니다. 암세포 현탁액을 삽입막의 바닥면에 피펫팅하여 액체 돔을 형성합니다. 세포가 정착하고 멤브레인에 부착될 수 있도록 배양합니다.

인서트를 뒤집어 미디어를 배출합니다. 막의 바닥면에 부착된 암세포에 영양을 공급하기 위해 성장 배지가 들어 있는 신선한 배양 접시에 삽입물을 옮깁니다. 이제 중피 세포 현탁액을 인서트 웰에 추가합니다. 세포가 막의 반대쪽에 부착되도록 배양하여 두 세포 유형 사이의 직접적인 접촉을 거부합니다.

배양하는 동안 두 세포 유형 모두 신호 전달 인자를 분비합니다. 이 분자는 다공성 막을 통해 인접한 세포를 향해 확산됩니다. 그들은 특정 세포 수용체에 결합하고 두 세포 유형 모두에서 복잡한 신호 전달 캐스케이드를 유도합니다.

40-60초 동안 0.25% 트립신 1밀리리터와 80% 합류 혼합물에서 난소암 세포를 분리한 다음 6밀리리터의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 신선한 완전 성장 배지에 재현탁합니다.

계수 후, 세포를 완전 성장 배지 농도 밀리리터당 100,000개의 난소암 세포로 희석하고, 실험 조건에 따라 거꾸로 된 0.4마이크로미터 기공 조직 배양 처리된 폴리카보네이트 멤브레인 세포 배양 인서트 3개를 적절한 크기의 멸균 조직 배양 접시에 넣습니다. 실험 조건에 따라 인서트에 라벨을 붙이고 막 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하여 800마이크로리터 돔을 형성하기 위해 동심원 모양으로 각 인서트의 바닥에 암세포를 조심스럽게 피펫팅합니다.

양 중에 배지 함유 세포의 돔이 인서트의 가장자리에서 흘러나오지 않도록 인서트의 바닥 표면에 세포를 시딩할 때 각별히 주의하십시오.

모든 삽입물이 시딩되면 접시를 덮고 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 약 4시간 후, 1-2분 동안 0.25% 트립신 2밀리리터로 HPMC를 분리한 후 완전 성장 배지 12밀리리터로 반응을 중화합니다.

원심분리를 통해 HPMC를 수집하고 계수를 위해 펠릿을 10밀리리터의 완전 성장 배지에 재현탁합니다. 세포를 완전 성장 배지 밀리리터당 300,000 HPMC로 희석하고 6웰 배양 플레이트의 각 웰에 2.5밀리리터의 신선한 완전 성장 배지를 추가합니다.

멸균 겸자를 사용하여 각 인서트의 오른쪽이 위로 향하도록 6웰 플레이트의 각 웰에 배치하여 하부 난소암 세포 부착 표면이 배지에 잠기도록 합니다. 그런 다음 각 인서트의 웰에 1.5밀리리터의 HPMC를 시드하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 72시간 동안 넣습니다.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).