근위 배양 시스템: 세포 간의 부분비 신호 전달을 연구하기 위한 체외 배양 기술

측분비 신호 전달에서 세포는 인접 세포에서 반응을 유도하는 신호 분자를 생성하고 분비합니다. 측분비 신호 전달을 모방하려면 난소암 세포와 중피 세포의 단일 세포 현탁액을 적절한 배지에서 준비하는 것부터 시작합니다.

다음으로, 멸균 배양 접시에 거꾸로 된 다공성 막 삽입물을 취합니다. 암세포 현탁액을 삽입막의 바닥면에 피펫팅하여 액체 돔을 형성합니다. 세포가 정착하고 멤브레인에 부착될 수 있도록 배양합니다.

인서트를 뒤집어 미디어를 배출합니다. 막의 바닥면에 부착된 암세포에 영양을 공급하기 위해 성장 배지가 들어 있는 신선한 배양 접시에 삽입물을 옮깁니다. 이제 중피 세포 현탁액을 인서트 웰에 추가합니다. 세포가 막의 반대쪽에 부착되도록 배양하여 두 세포 유형 사이의 직접적인 접촉을 거부합니다.

배양하는 동안 두 세포 유형 모두 신호 전달 인자를 분비합니다. 이 분자는 다공성 막을 통해 인접한 세포를 향해 확산됩니다. 그들은 특정 세포 수용체에 결합하고 두 세포 유형 모두에서 복잡한 신호 전달 캐스케이드를 유도합니다.

40-60초 동안 0.25% 트립신 1밀리리터와 80% 합류 혼합물에서 난소암 세포를 분리한 다음 6밀리리터의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 신선한 완전 성장 배지에 재현탁합니다.

계수 후, 세포를 완전 성장 배지 농도 밀리리터당 100,000개의 난소암 세포로 희석하고, 실험 조건에 따라 거꾸로 된 0.4마이크로미터 기공 조직 배양 처리된 폴리카보네이트 멤브레인 세포 배양 인서트 3개를 적절한 크기의 멸균 조직 배양 접시에 넣습니다. 실험 조건에 따라 인서트에 라벨을 붙이고 막 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하여 800마이크로리터 돔을 형성하기 위해 동심원 모양으로 각 인서트의 바닥에 암세포를 조심스럽게 피펫팅합니다.

배

양 중에 배지 함유 세포의 돔이 인서트의 가장자리에서 흘러나오지 않도록 인서트의 바닥 표면에 세포를 시딩할 때 각별히 주의하십시오.

모든 삽입물이 시딩되면 접시를 덮고 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 약 4시간 후, 1-2분 동안 0.25% 트립신 2밀리리터로 HPMC를 분리한 후 완전 성장 배지 12밀리리터로 반응을 중화합니다.

원심분리를 통해 HPMC를 수집하고 계수를 위해 펠릿을 10밀리리터의 완전 성장 배지에 재현탁합니다. 세포를 완전 성장 배지 밀리리터당 300,000 HPMC로 희석하고 6웰 배