0 조회수 • 3:34 분 • April 30th, 2023
복막 또는 복강을 감싸는 막은 섬유혈관 결합 조직 층 위에 지지되는 복막 중피 세포를 구성합니다. 전이성 난소암 세포는 이 복막 내막에 달라붙어 암성 종양으로 증식합니다.
난소암 전이를 모델링하려면 먼저 인간 섬유아세포를 원추형 튜브에 넣고 세포외 기질 단백질인 콜라겐과 혼합합니다. 현탁액을 배양 접시에 접시합니다. 섬유아세포를 매립하고 복막의 결합 조직을 모방하기 위해 콜라겐 기질 응고를 촉진하기 위해 배양합니다.
다음으로, 섬유아세포-콜라겐층 위에 중피세포의 현탁액을 추가합니다. 중피 세포가 부착되어 섬유아세포-콜라겐층 표면에 단층을 형성할 수 있도록 플레이트를 배양합니다. 이 3D 기관형 배양은 이제 생체 내 복막 내벽의 구성과 구조를 모방합니다.
마지막으로, 이 기관형 배양물을 난소암 세포와 함께 파종하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 난소암 세포는 중피층을 변경하여 암세포 부착 및 침습을 강화하고 생체 내 전이 상태를 모방하는 특정 신호 분자를 방출합니다.
배양에서 정상적인 대망 섬유아세포를 방출하려면 배양 플라스크를 10밀리리터의 PBS로 헹구고 3밀리리터의 트립신을 5분 이상 동안 헹굽니다. 세포가 분리되면 전체 성장 배지 부피의 최소 3배로 트립신을 중화하고 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 회전시키고 펠릿을 5밀리리터의 완전 성장 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수하고 전체 성장 배지 농도의 100마이크로리터당 10 내지 3번째 섬유아세포의 2 내지 4배로 희석합니다.
다음으로, 쥐 꼬리 콜라겐 I 100마이크로리터당 0.5마이크로그램을 세포에 첨가하고 웰당 100마이크로리터의 세포를 검은색의 투명한 바닥 96웰 플레이트에 도금합니다. 그런 다음 플레이트를 최소 4시간 동안 또는 세포가 플레이트 표면에 부착될 때까지 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 정상적인 대망 섬유아세포가 침전되는 동안 HPMC를 배양 플라스크에서 분리하고 이 세포를 전체 성장 배지 50마이크로리터당 10배 10 내지 4 HPMC로 희석합니다.
그런 다음 부착된 정상 대망 섬유아세포에 웰당 50마이크로리터의 HPMC를 추가하고 실험 사용 전 최소 18시간 동안 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음날, 원하는 다운스트림 분석을 위한 적절한 희석액으로 80% 내지 90% 합류 배양에서 GFP를 발현하는 난소암 세포와 3D 기관형 공동 배양물을 시종합니다.