0 조회수 • 4:34 분 • April 30th, 2023
난소암 전이 동안 악성 세포는 원발성 종양 부위에서 분리되어 복막강 내에서 순환하기 시작합니다. 그런 다음 이 세포는 복막강을 감싸고 있는 중피 세포 단층에 부착되는 클러스터 또는 스페로이드를 형성할 수 있습니다. 종양이 자라면서 침범을 촉진하기 위해 밑에 있는 중피 세포를 제거합니다.
중피 제거율을 모델링하려면 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 발현하는 중피 세포를 피브로넥틴 코팅된 유리 바닥 배양 접시에 파종하는 것으로 시작합니다. 피브로넥틴 코팅은 세포 부착을 촉진하는 매트릭스를 제공합니다. 접시를 배양하여 중피 세포가 퍼지고 단층을 형성할 수 있도록 합니다.
다음으로, 적색 형광 단백질을 발현하는 난소암 세포 스페로이드의 현탁액을 중피 단층으로 옮깁니다. 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 장기간 동안 배양을 이미지화합니다. 적색 형광 스페로이드는 침착되어 녹색 형광 중피 단층에 부착됩니다.
암세포는 중피 세포에 힘을 가하여 세포 접합부를 방해하고 중피층 무결성을 변경합니다. 힘은 또한 밑에 있는 중피 세포를 변위시켜 구멍을 생성합니다. 적절한 GFP 필터 설정을 선택하여 결과 구멍을 이미지의 검은색 공간으로 시각화합니다. 중피 청소의 정도를 정량화하기 위해 공간을 측정합니다.
이 절차를 시작하려면 6웰 유리 바닥 MatTek 접시의 웰을 피브로넥틴으로 미리 코팅합니다. 접시의 각 웰에 피브로넥틴/PBS 용액 2밀리리터를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 중피 세포 단층을 형성하기 위한 녹색 형광 단백질 발현 중피 세포를 10% 염기 배지에서 배양합니다. 중피 세포 플레이트를 트립신화하고 탁상용 원심분리기에서 900RPM으로 3분 동안 회전시킵니다.
상청액을 흡인하고 세포를 10% 염기 배지에 재현탁합니다. 10% 기본 배지로 원하는 농도로 조정합니다. MatTek 접시의 30분 피브로넥틴 배양이 완료되면 2밀리리터의 PBS로 웰을 세척합니다. PBS를 흡인하고 6웰 MatTek 접시의 각 웰에서 웰당 다섯 번째 중피 세포에 10회 6회 플레이트합니다. MatTek 접시를 섭씨 37도 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양하여 중피 세포가 접시에 부착되어 단층을 형성할 수 있도록 합니다.
피펫을 사용하여 96웰 폴리-HEMA 코팅 플레이트에서 난소암 스페로이드를 수집합니다. 중피 세포 단층을 포함하는 6웰 MatTek 접시의 한 웰에서 배지를 흡인합니다. PBS 2밀리리터로 한 번 세척하십시오. 96웰 플레이트의 모든 스페로이드를 MatTek 접시의 웰 1개에 추가합니다. 이것은 이미지화할 수 없는 접시 부분에 착지하는 스페로이드를 설명하기 위해 이미지화될 스페로이드 수의 약 3배입니다.
시야당 하나의 스페로이드만 이미지화하고 싶기 때문에 스페로이드의 집계를 피해야 합니다. 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 스페로이드가 부착되기 전에 단층 전체에 고르게 분포시킵니다.
최소 8시간 동안 타임랩스 이미징을 수행할 수 있는 도립 광시야 형광 현미경의 스테이지에 MatTek 접시를 놓습니다. 전동 스테이지를 사용하여 단일 실험에서 여러 스페로이드 삽입 이벤트와 함께 접시의 여러 위치를 이미지화합니다. 난소암 세포 스페로이드는 접시 바닥에 침전되어 중피 세포 단층에 부착됩니다. 8시간 동안 10분마다 20개 이상의 스페로이드/단층 상호 작용의 GFP, RFP 및 위상 이미지를 수집합니다.