아가로스 스핀 다운 분석법: 조직학적 분석을 위해 오가노이드를 삽입하는 기법

암세포의 3D 오가노이드 배양은 인간 암의 많은 병태생리학적 특징을 요약합니다. 따라서 이러한 시험관 내 배양은 암 연구를 위한 훌륭한 모델을 형성합니다.

이러한 오가노이드를 처리하기 위해 적절한 기저막 매트릭스에서 성장한 미리 형성된 3D 오가노이드의 배양으로 시작합니다. 원하는 세포 회수 배지를 추가하고 배양합니다. 배지는 매트릭스 겔의 해중합을 촉진하여 3D 오가노이드를 용액으로 방출합니다.

이 혼합물을 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다. 매트릭스 성분을 포함하는 회수 매체는 상청액에 남아 있습니다. 상청액을 버리십시오. 다음으로, 오가노이드 펠릿에 파라포름알데히드 용액을 첨가합니다. 화학 물질은 오가노이드 세포에 들어가 아미노산에 결합하여 단백질 가교 및 샘플 고정을 일으킵니다. 이 단계는 모든 다운스트림 조직학적 응용 분야에 필수적입니다.

오가노이드를 펠릿화하여 파라포름알데히드 함유 상청액을 분리하고 제거합니다. 따뜻하게 녹인 아가로스를 오가노이드에 첨가합니다. 바늘을 사용하여 펠릿화된 오가노이드를 분리하고 액체 아가로스에 분산시킵니다. 아가로스가 응고되고 오가노이드를 포매하도록 합니다. 다운스트림 조직학적 분석을 위해 오가노이드 함유 아가로스 플러그를 사용하십시오.

조직학을 위해 오가노이드를 처리하려면 기저막 돔이 흡인되지 않도록 주의하면서 우물에서 기존 배지를 제거합니다. 같은 부피의 세포 회수 용액을 첨가하고 플레이트를 섭씨 4도에서 60분 동안 배양합니다.

배양 후 피펫을 사용하여 기저막 돔을 제거하고 피펫 팁으로 부수십시오. 해리된 돔과 세포 회수 용액을 1.5밀리리터 튜브에 모으십시오. 튜브를 섭씨 300 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 따로 보관합니다.

오가노이드의 존재가 확인되는 마지막 단계까지 모든 상청액을 저장하십시오. 원하는 양의 차가운 PBS를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 오가노이드를 방해하지 않고 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 원심분리를 반복하고 상청액을 제거합니다.

펠릿을 실온에서 60분 동안 4% PFA의 일치 부피로 고정합니다. 고정 후 원심분리 단계와 PBS 세척을 반복합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 따뜻한 2% 아가로스를 천천히 첨가하고 1밀리리터 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 사용하여 세포 펠릿을 방해하지 않고 튜브 벽에서 즉각적이지만 부드럽게 분리합니다.

아가로스 스핀 다운 방법의 경우 25게이지 바늘을 사용하여 아가로스를 첨가한 직후 튜브 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 것이 중요합니다.

아가로스가 완전히 응고되면 25밀리리터 주사기에 부착된 1게이지 바늘로 튜브에서 분리하고 새 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브에 70% 에탄올을 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포매를 위한 기존 프로토콜을 진행합니다.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
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