단백질 용해물 추출: 세포 단백질을 수집하기 위해 오가노이드를 용해하는 기술

세포 용해물 또는 용해된 세포 내용물을 포함하는 유체는 단백질 추출 및 분석과 같은 다운스트림 공정에 적용됩니다. 이러한 분획을 연구하면 세포의 특성과 기능에 대한 정보가 드러납니다.

오가노이드 단백질 용해물을 제조하려면 원하는 기저막 매트릭스에서 성장한 오가노이드 배양으로 시작합니다. 접시에서 사용한 배양 배지를 제거합니다. 매트릭스 위에 프로테아제를 함유한 따뜻한 배지를 추가합니다. 접시에서 매트릭스를 제거하기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.

혼합물을 배양합니다. 배지의 단백질 분해 효소는 매트릭스를 분해하고 오가노이드를 용액으로 방출합니다. 샘플을 원심분리하여 효소 함유 상청액에서 오가노이드를 분리합니다.

오가노이드 펠릿을 적절한 단백질 용해 완충액에 재현탁합니다. 샘플을 배양합니다. 완충액의 세제는 오가노이드의 세포막을 파괴하여 세포 내 내용물을 용액으로 방출합니다. 동시에, 완충액의 단백질 억제제는 방출된 프로테아제 및 포스파타제 효소를 비활성화하여 기질 단백질의 분해를 방지합니다.

또한, 혼합물을 초음파 처리하여 세포를 완전히 파괴하십시오. 핵막이 파열되어 핵 단백질이 용액으로 방출됩니다. 음파는 또한 방출된 핵산을 전단하여 단백질 용해물을 오염시키는 것을 방지합니다.

오가노이드를 수집하려면 전체 링이 제거될 때까지 예열된 분산효소 함유 배지 1밀리리터를 매트릭스 겔 링에 직접 피펫팅하여 매트릭스 겔을 반복적으로 분사합니다. 제거된 매트릭스 겔 오가노이드 혼합물을 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 완전한 소화 후, 오가노이드 펠릿에 인산염 완충 식염수를 첨가하고 부드럽게 튕겨 재현탁합니다.

실온에서 5분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화하고 마이크로피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 오가노이드 펠릿을 포장된 세포 부피 100마이크로리터당 단백질 용해 완충액 100마이크로리터에 재현탁합니다. 다시 일시 중단하려면 넘깁니다. 이제 튜브를 젖은 얼음에 담그고 음파 제거기의 끝을 미세 원심분리기 튜브의 외부에 부드럽게 적용하여 오가노이드를 초음파 처리합니다. 확립 된 프로토콜로 웨스턴 블로팅을 진행하기 전에 20kHz에서 40 초 동안 초음파 처리하십시오.