전체 마운트 면역형광 이미징: 온전한 오가노이드를 평가하기 위한 고정 및 염색 기법

전립선 오가노이드는 주로 기저 상피 세포의 외부 층과 중앙 내강 주위에 배열된 내강 상피 세포의 내부 층을 구성합니다.

전체 마운트 이미징을 사용하면 형태와 이질성을 유지하면서 온전한 3D 오가노이드를 연구할 수 있습니다. 염색을 시작하려면 오가노이드를 적절한 고정제로 처리하여 세포 구성 요소를 제자리에 고정하여 보존합니다. 샘플을 세척하여 과도한 고정액을 제거합니다.

차단 용액과 DNA 염색 염료의 칵테일과 함께 배양합니다. 차단 용액의 단백질은 세포의 비특이적 부위에 수동적으로 결합하여 배경 염색을 줄입니다. 동시에 DNA 염색 염료는 세포의 핵을 염색합니다.

두 개의 구성 세포 집단에 의해 발현되는 특정 항원을 표적으로 하는 두 세트의 1차 항체를 추가합니다. 1차 항체에 결합하는 두 가지 다른 형광 염료 접합 2차 항체와 함께 배양합니다. 샘플을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

염색된 오가노이드를 증가하는 계면활성제 함유 설탕 용액에 순차적으로 담가두어 오가노이드 구조를 손상시키지 않고 조직 투명성을 향상시킵니다. 이 처리는 샘플의 이미징 깊이를 향상시킵니다.

이미징하는 동안 3D 형태를 보존하기 위해 스페이서가 있는 현미경 슬라이드에 오가노이드를 장착합니다. 공초점 현미경을 사용하여 중앙 내강 주위에 배열된 기저 및 내강 세포 집단의 형광 방출을 관찰합니다.

전립선 오가노이드의 전체 마운트 면역형광 염색을 수행하려면 먼저 PBS에 500마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 첨가합니다. 오가노이드를 실온에서 부드럽게 흔들면서 2시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 펠릿을 세척한 후, 차단 용액에 DAPI 염색제 밀리리터당 1마이크로그램을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이 단계부터 배양하는 동안 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. 이전과 같이 오가노이드를 원심분리한 후, 1차 항체와 차단 용액을 첨가하고 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들면서 밤새 배양합니다.

오가노이드를 다시 펠릿화하고 1밀리리터의 PBS로 펠릿을 부드럽게 흔들면서 15분 동안 세척합니다. 이 세탁 절차를 두 번 반복하십시오. 그런 다음 2차 항체와 차단 용액을 첨가하고 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들면서 밤새 배양합니다. 배양 후, 오가노이드를 펠릿화하고 펠릿을 추가로 2회 세척합니다. 1% Triton X-100이 포함된 PBS에 30% 자당 1밀리리터를 펠릿화된 오가노이드에 첨가합니다. 그런 다음 실온에서 부드럽게 흔들면서 2시간 동안 배양합니다.

오가노이드를 다시 펠릿화한 후, 1% Triton X-100이 포함된 PBS에 45% 자당 1밀리리터를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 1% Triton X-100과 함께 PBS에 60% 자당 1밀리리터를 첨가하는 것을 제외하고 절차를 반복합니다. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화하고 상층액의 95%를 제거합니다. 자외선 아래에서 펠릿을 관찰하여 상청액을 제거하는 동안 펠릿이 손실되지 않았는지 확인합니다. 자당의 농도가 높아질수록 펠릿은 느슨해집니다. 나머지 현탁액 중 10-20마이크로리터를 챔버가 있는 커버슬립으로 옮기고 공초점 현미경 검사를 진행합니다.