기능성 와이어 기반 표적 세포 분리: 스파이크된 말초 혈액에서 암세포를 분리하는 생체 외 기술

상피 세포 접착 분자(EpCAM)는 전립선암에서 빠르게 증식하는 상피 세포에서 과발현되는 표면 막관통 당단백질입니다. EpCAM 발현 세포를 분리하려면 기능화된 금 코팅 팁이 있는 의료용 와이어로 시작합니다. 기능화는 공유 결합된 EpCAM 특이적 항체를 포함하는 고분자 겔을 층화합니다.

형광 표지된 암세포가 포함된 말초 혈액 현탁액에 와이어를 담그십시오. 기능화된 부분이 혈액 현탁액에 담근 상태로 남아 있는지 확인하십시오. 암세포의 EpCAM은 와이어에서 기능화된 특정 항체를 인식하고 결합합니다.

완충액으로 세척하여 와이어 표면에서 결합되지 않은 세포를 제거합니다. 와이어를 구부려 완충액이 포함된 유리 슬라이드에 장착하고 기능화된 부분을 완충액에 담그십시오. 형광 현미경을 사용하여 세포 세포질과 핵의 밝은 형광을 확인하고 와이어에 포획된 세포가 있는지 확인합니다.

이형 버퍼로 와이어를 처리하십시오. 완충액의 단백질 분해 효소는 고분자 겔을 절단하여 항체-암세포 복합체를 완충액으로 방출합니다. 와이어 어셈블리를 원심분리하여 펠릿에서 방출된 항체-세포 복합체를 수집합니다. 와이어와 효소 함유 상청액을 제거합니다. 표적 세포 함유 펠릿을 적절한 배지에 재현탁합니다.

초혈액 5밀리리터에 약 500-500,000개의 세포를 첨가한 후 튜브를 거꾸로 섞는다. 보관함에서 와이어를 제거한 후 와이어를 고정하는 고무 캡을 제거하고 와이어를 1x 인산염 완충 식염수로 세척한 다음 튜브 캡에 장착합니다. 그런 다음 기울어진 롤러 믹서에서 튜브를 분당 5회전으로 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 와이어를 1x 인산염 완충 식염수로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 어둠 속에서 1x 인산염 완충 식염수가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 와이어를 보관합니다.

그리스 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 직사각형 영역을 그리고 그 위에 500마이크로리터의 1x 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 와이어의 기능 부분을 1x 인산염 완충 식염수에 담그려면 와이어의 비기능 부분을 구부려 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 캡처된 셀의 수를 계산하려면 와이어의 양쪽을 육안으로 검사하십시오. 검사 후 와이어를 1x 인산염 완충 식염수와 함께 15밀리리터 튜브에 다시 옮기고 어둠 속에 보관합니다.

1x 인산염 완충 식염수 1밀리리터에 방출 완충액 성분 4mg을 녹입니다. 그런 다음 0.2마이크로미터 멸균 필터를 통해 용액을 여과하여 바로 사용할 수 있는 완충액을 얻습니다. 다음으로, 방출 완충액을 섭씨 37도에서 5분 동안 예열합니다. 예열되면 1.6밀리리터의 방출 완충액을 옮겨 1.5밀리리터 반응 튜브를 완전히 채웁니다. 다음으로, 와이어의 기능적 부분을 섭씨 37도의 방출 완충액에서 수조에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 와이어를 셰이커에 분당 500회 회전으로 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 와이어를 300 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브에서 와이어를 제거하고 캡을 닫은 다음 튜브를 300 x g으로 10분 동안 다시 원심분리합니다.