0 조회수 • 4:33 분 • April 30th, 2023
화학 저항성 세포를 생성하려면 먼저 인간 전립선암 세포 현탁액을 배양 플라스크에 넣으십시오. 플라스크를 배양하여 세포 부착 및 분열을 촉진하여 단층을 형성합니다.
세포에 최적의 농도의 항암제 용액을 보충하고 배양합니다. 약물 분자는 세포에 들어가 민감한 세포에서 세포사멸을 유도합니다.
일부 세포는 주기적으로 약물을 제거하는 특수 약물 유출 수송체 또는 펌프를 발현합니다. 이 메커니즘은 약물 축적을 방지하여 이러한 세포가 항암제의 효과를 견디고 화학 저항성을 갖게 합니다.
배양액에서 약물 및 파편 함유 배지를 흡인합니다. 화학 저항성 세포의 성장을 지원하기 위해 새로운 약물이 없는 성장 배지를 보충하십시오. 사용한 배지를 버립니다. 세포를 트립신화하여 배양 플라스크에서 분리하고 튜브로 옮깁니다.
튜브를 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 트립신 함유 상청액을 제거합니다. 세포를 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 새 배양 플라스크에서 세포를 성장시킵니다.
그 후, 약물 치료 및 세포 배양 단계를 반복하여 화학 내성 세포를 동일한 항암제의 증량 용량에 노출시킵니다. 이 기술은 모든 민감한 세포를 제거하여 화학 저항성이 높은 생존 세포 풀을 생성함으로써 배양을 스크리닝합니다.
이 절차를 시작하려면 20밀리리터의 배지가 들어 있는 150센티미터 정사각형 플라스크에 DU145 또는 22Rv1 세포를 도금합니다. 24시간 후, 세포가 약 70% 내지 80% 합류에 있을 때, 도세탁셀을 5나노몰로 첨가한다.
72시간 후, 약물 함유 배지를 흡인하고 새로운 도세탁셀이 없는 배지를 추가합니다. 3-4일마다 용지를 교체하고 클론이 플라스크에 나타날 때까지 1-2주 동안 기다립니다. 미디어를 흡인하십시오. 15밀리리터의 PBS로 세포를 조심스럽게 세척하고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 4밀리리터의 0.05% 트립신-EDTA와 함께 배양하여 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 8 밀리리터의 신선한 배지를 사용하여 플라스크에서 트립신화된 세포를 재현탁합니다.
처리된 모든 플라스크에서 세포를 모으고 원심분리로 펠릿화합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 20밀리리터의 신선한 배지에 재현탁하고 세포를 150cm 제곱 플라스크에 도금합니다.
24시간 후, 세포가 약 70% 내지 80% 합류에 이르면 5나노몰 도세탁셀을 다시 첨가한다. 클론이 플라스크에 나타날 때까지 이전에 표시된 절차를 반복합니다. 그런 다음 150cm 정사각형 플라스크에 세포를 다시 도금합니다.
24시간 후 세포가 약 70%에서 80% 합류하면 10나몰 도세탁셀로 처리합니다. 도세탁셀 용량 증량 방식으로 동일한 단계를 반복하고 모든 농축 처리 후 생존 클론을 계속 풀링합니다. 프로세스가 끝나면 실험적으로 사용할 준비가 된 저항성 세포 풀을 얻게 됩니다.