전립선암 세포의 ADI 기반 자가포식 유도: 세포의 자가포식 반응을 측정하기 위한 효소 기반 기술

자가포식은 리소좀이라고 하는 특수한 소화 구획 내에서 원치 않는 세포질 성분과 소기관의 분해를 촉진하는 세포 내 과정입니다. 자가포식을 평가하려면 녹색 형광 단백질과 결합된 LC3라고 하는 자가포식 마커 단백질을 발현하는 전립선암 세포의 부착 배양으로 시작합니다.

질적으로 전립선암 세포에는 아르기닌 아미노산 합성에 필요한 효소인 아르기니노숙시네이트 합성효소가 부족합니다. 따라서 이러한 세포는 생존과 증식을 위해 배지를 통한 외부 아르기닌 보충에 의존합니다.

다음으로, 아르기닌 데이미나제 또는 ADI로 세포를 처리합니다. ADI는 배지에서 유리 아르기닌을 가수분해하여 아르기닌 고갈을 유발합니다. 결과적으로 세포는 대사 스트레스를 받아 내부적으로 자가포식 반응을 시작합니다. 동시에 세포 내의 리소좀을 표지하는 적색 형광 염료로 세포를 처리합니다.

자가포식 동안 식식체라고 하는 컵 모양의 막 구조가 손상된 세포질 구성 요소 주위에 조립됩니다. 결국, 그들은 자가포식 마커 단백질 LC3와 접합하여 이중막 소포 또는 자가포식체를 형성하면서 화물을 팽창하고 밀봉합니다. LC3 단백질은 또한 자가포식체에 형광 태그를 제공합니다. 그런 다음 소포는 리소좀과 융합하여 자가리소좀을 형성합니다. 자가리소좀 내의 리소좀 프로테아제는 삼켜진 세포 성분을 분해합니다.

실시간으로 자가포식체와 리소좀의 밝은 형광을 관찰하여 세포 내 분포를 결정합니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 35mm 폴리-D-라이신 코팅 유리 바닥 배양 접시에서 녹색 형광 단백질 결합 경쇄 3을 발현하는 인간 전립선암 세포를 성장시킵니다.

세포는 빠른 증식을 촉진하기 위해 충분한 밀도로 도금되어야 하지만, 이미징 시점까지 세포가 과도하게 자라거나 뭉쳐질 정도로 도금되어서는 안 됩니다. 선택된 세포 샘플을 PBS에서 아르기닌 데아미나제 또는 ADI로 처리하여 세포의 유리 아르기닌을 고갈시키고 암세포에서 대사 스트레스를 유도합니다.

이미징 약 1시간 전에 1.5마이크로리터의 LysoTracker Red를 10% FBS 및 1% 항생제를 함유한 RPMI 20밀리리터로 희석합니다. 처리된 선택된 샘플에 대해 ADI로 용액을 준비합니다.

모든 배지를 섭씨 37도로 데운 후 각 배양 접시에 적절한 배지를 추가합니다. LysoTracker Red를 함유한 RPMI와 함께 세포를 섭씨 37도에서 15-45분 동안 배양합니다.

이미징 약 30분 전에 기상 관측소 환경 인클로저를 켜고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 평형을 유지합니다. PBS로 세포를 세척하고 10% FBS와 1% 항생제만 포함된 표준 RPMI로 배지를 교체합니다.

표시된 대로 샘플에 ADI를 추가합니다. 맞춤형 어댑터에 35mm 커버 유리 바닥 배양 접시를 장착합니다. 60X 배율, 1.42 개구개 대물 렌즈에 침지 오일을 사용하고 장착된 배양 접시를 현미경 스테이지에 배치합니다.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.