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암 연구
0 조회수 • 4:03 분 • April 30th, 2023
전립선 종양 조직 샘플로 시작하십시오. 세포 용해를 시작하기 위해 냉각된 용해 완충액에 재현탁합니다. 균질화기를 사용하여 조직 구조를 더 분해하고 세포내 성분을 방출합니다. 완전한 세포 용해를 보장하기 위해 얼음 위에서 샘플을 초음파 처리하고 펩타이드 처리 중 간섭을 방지하기 위해 DNA를 전단합니다. 용해물을 가열하여 단백질의 3차 구조를 파괴하고 펼칩니다.
완충액의 환원제는 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 절단합니다. 그 후, 완충액의 알킬화제는 환원된 시스테인의 유리 티올기를 알킬화하여 이황화 결합 재형성을 방지합니다. 완충액의 추가 변성제는 제어된 변성과 단백질의 추가 풀림을 촉진합니다.
원심분리하여 조직 파편과 오염 물질을 펠릿화합니다. 단백질 혼합물을 포함하는 상청액을 신선한 튜브에 모으십시오. 라이실 엔도펩티다제 효소를 첨가하여 라이신 잔기의 C 말단에서 단백질의 펩타이드 결합을 절단하여 큰 펩타이드를 형성합니다. 또한, 효소 트립신으로 처리하여 라이신 및 아르기닌 잔기의 C 말단에서 펩타이드 결합을 절단하고 더 작은 펩타이드를 생성합니다. 혼합물을 원심 필터 장치로 옮깁니다.
원심분리하여 소화된 펩타이드가 필터 멤브레인의 기공을 통해 침투하고 흐름으로 수집되도록 합니다. 더 큰 조각은 잔류물로 남아 있습니다.
종양 조직을 수확하려면 종양의 무게를 측정하고 배양 시험관에 조직 100mg당 얼음처럼 차가운 용해 완충액 2ml를 첨가합니다. 그런 다음 휴대용 또는 탁상용 균질화기를 사용하여 용해물을 균질화합니다.
샘플을 환원 및 알킬화하려면 튜브를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열한 다음 얼음 위에서 15분 동안 샘플을 냉각합니다. 얼음 위에 있는 동안 용해물을 세 번 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.
이 초음파 처리 튜브를 스윙 버킷 로터에 넣고 용해물을 3,500 x g 및 섭씨 15도에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다. 용해물을 분해하려면 100밀리몰 트리스를 사용하여 샘플을 12배 희석하여 구아니디늄의 양을 줄입니다. 단백질 5mg의 경우 10마이크로그램의 Lysyl Endopeptidase 또는 Lys-C를 첨가하고 샘플을 실온에서 5-6시간 동안 배양합니다.
20밀리몰 염화칼슘과 트립신을 1 내지 100 트립신 대 단백질 비율로 첨가한 1밀리몰 HCl에 TPCK 처리 트립신 밀리리터당 1밀리그램을 준비합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브에 트립신의 분취량을 추가하고 샘플을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
샘플을 15밀리리터, 10kDa 컷오프 필터에 추가합니다. 머무름 부피가 250마이크로리터 미만이 될 때까지 스윙 버킷 또는 고정 각도 로터에서 3,500 x g 및 섭씨 15도에서 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 플로우 스루를 수집하고 잔류물을 폐기합니다.