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암 연구
0 조회수 • 3:21 분 • April 30th, 2023
펩타이드를 분리하고 정제하려면 소화된 펩타이드의 혼합물을 포함하는 단백질 용해물의 현탁액으로 시작합니다.
혼합물을 트리플루오로아세트산 또는 TFA 기반 시약으로 처리합니다. 이 음이온성 또는 음전하를 띤 시약은 펩타이드에 염기성 또는 양전하를 띤 잔기와 이온쌍 복합체를 형성하여 전하를 마스킹하고 펩타이드 소수성을 개선합니다.
이제 비극성 소수성 리간드로 고정된 다공성 실리카 기반 고정상을 포함하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼을 조립합니다. 펩타이드 호환 평형 완충액을 컬럼에 추가하여 시료 적용 전에 고정상을 준비합니다.
이제 산성화된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 컬럼 내에서 소수성 펩타이드는 고정상의 소수성 리간드에 선택적으로 흡착됩니다. 컬럼을 통해 세척 완충액을 실행하여 결합되지 않거나 원치 않는 입자를 용리합니다.
다음으로, 소수성이 높은 극성이 낮은 유기 용출 완충액을 컬럼을 통과시킵니다. 용출 완충액에 대한 선택적 친화력으로 인해 결합된 펩타이드는 컬럼 매트릭스에서 탈착됩니다.
컬럼에서 펩타이드 함유 용출액을 수집합니다. 용출액을 동결건조하여 수분 함량을 제거하고 순수하고 안정적인 펩타이드의 건조 분말을 얻습니다.
샘플을 산성화하려면 용해물 밀리리터당 약 20마이크로리터의 5% 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가합니다. 튜브를 잘 섞고 pH 스트립을 사용하여 pH를 측정합니다. 필요한 경우 5% TFA를 추가하여 pH를 2.5로 조정합니다. 그런 다음 C18 컬럼의 짧은 쪽 끝을 진공 매니폴드에 연결합니다. 진공을 17에서 34kPa 사이로 설정한 후 100% 아세토니트릴 3밀리리터와 유리 피펫을 사용하여 컬럼을 적십니다.
유리 피펫을 사용하고 0.1% TFA의 3밀리리터 분취량 2개를 도포하여 컬럼의 평형을 맞춥니다. 그런 다음 산성화된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 3밀리리터 부피의 0.1% TFA 3개를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 40% ACN, 0.1% TFA 2밀리리터를 도포하여 샘플을 용리하고 2밀리리터 분획 2개를 유리 배양 튜브에 수집합니다. 파라필름을 사용하여 용출액 튜브를 덮고 20게이지 바늘을 사용하여 덮개에 3-5개의 구멍을 뚫은 후 샘플을 밤새 동결건조합니다.