인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

티로신과 같은 특정 아미노산 잔기의 인산화는 여러 세포 신호 전달 경로를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 인산펩타이드를 생성합니다. 이를 연구하면 암 치료를 위한 잠재적인 바이오마커를 식별할 수 있습니다.

인산펩타이드를 분리하려면 암 조직에서 추출한 정제된 펩타이드 분해물의 동결건조 분말로 시작합니다. 균일한 펩타이드 현탁액을 준비하기 위해 분말을 적절한 완충액에 재현탁합니다. 펩타이드 안정성을 보장하기 위해 중성 pH를 유지하십시오.

원하는 완충액에서 특정 항-인화펩티드 항체에 접합된 하이드로겔 비드로 구성된 슬러리를 준비합니다. 펩타이드 현탁액에 비드 슬러리를 첨가합니다. 비드에 고정된 항체는 인화펩티드 내의 특정 인산화 아미노산 잔기를 인식하고 결합하여 복합체를 형성합니다.

혼합물을 원심분리하여 펠릿에 포스포펩타이드-비드 복합체를 수집합니다. 결합되지 않은 펩타이드 또는 비특이적 인산펩타이드를 포함하는 상청액을 제거합니다. 복합체에 적절한 저pH 용출 완충액을 첨가하고 배양합니다. 낮은 pH는 포스포펩티드 잔기와 항체-비드 복합체 사이의 상호 작용을 약화시켜 펩타이드를 용액으로 방출합니다.

혼합물을 사전 조립된 필터 카트리지로 옮깁니다. 원심분리하여 방출된 인산펩타이드를 수집 튜브로 용리합니다. 샘플을 고온에서 진공 농축하여 완충액을 제거하고 순수 포스포펩타이드의 농축된 건조 펠릿을 얻습니다.

동결건조된 분말을 각 분획에 0.5밀리리터의 얼음처럼 차가운 면역침전(IP) 결합 완충액으로 재현탁합니다. 0.5밀리리터 재현탁량을 두 번째 분획에서 첫 번째 분획이 있는 튜브로 옮기고 피펫 팁을 저장합니다. 내용물을 냉동 튜브로 옮기기 전에 또 다른 0.5밀리리터의 IP 완충액을 사용하여 각 동결건조 튜브를 헹굽니다. 그런 다음 IP 버퍼 2밀리리터를 사용하여 헹굼을 반복합니다.

절단 팁이 있는 P200을 사용하여 1밀리리터당 0.5mg의 항체 비드 슬러리 스톡을 마이크로퓨지 튜브로 옮긴 후, 450마이크로리터의 얼음처럼 차가운 IP 결합 완충액을 첨가하여 50마이크로리터의 4G10 항체 비드 슬러리 및 25마이크로리터의 27B10.4 항체 비드 슬러리를 마이크로퓨지 튜브에서 세척합니다. 튜브를 100 x g 및 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인한 후, IP 결합 완충액의 원래 슬러리와 동일한 부피를 추가하여 비드를 재현탁합니다. 스크류 캡 냉동관의 재현탁된 샘플 용액에 미리 세척된 pY 비드를 추가합니다. 그런 다음 하드오버엔드 로테이터에서 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 비드를 회전시킨 후 pST 펩타이드를 농축하는 데 사용할 상청액을 저장합니다.

다음으로, 300마이크로리터의 IP 결합 완충액을 사용하여 비드를 재현탁하고 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 100 x g 및 섭씨 4도에서 1분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 500마이크로리터의 IP 결합 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다. 450마이크로리터의 25mM 중탄산암모늄, pH 7.5로 비드를 4회 세척합니다. 젤 로딩 팁을 비드 표면 약간 아래에 담그고 상청액을 완전히 흡인합니다. 비드에 0.1% TFA의 4배에 달하는 비드 부피를 추가합니다.

그런 다음 잘 섞고 튜브를 열혼합기에서 1,000rpm, 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 재현탁액을 0.2마이크로미터 스핀 필터로 옮기고 필터를 850 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 용출액을 단백질 결합이 낮은 미세 원심분리기 튜브로 옮긴 후, 용출액을 밤새 300분의 가열 시간으로 섭씨 40도에서 건조되도록 진공 농축합니다.