게놈 DNA의 중아황산염 변환: 위장관 암 조직의 게놈 DNA 샘플에서 DNA 메틸화를 연구하는 방법

0 조회수4:36 • April 30th, 2023

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DNA 메틸화는 DNA의 시토신 잔기에 메틸기를 추가하여 메틸-시토신을 형성하여 DNA 변형 및 유전자 발현 조절을 유발하는 것을 포함합니다.

DNA 메틸화를 연구하려면 암세포에서 조잡한 DNA 추출물을 섭취하는 것부터 시작하십시오. 희석 완충액을 첨가하고 실온에서 배양합니다. 완충액은 혼합물을 희석하고 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성시켜 후속 반응을 위한 염기의 접근성을 선호합니다.

전환 시약을 넣고 어둠 속에서 배양합니다. 시약의 중아황산나트륨은 메틸화되지 않은 시토신 잔기의 설폰화 및 그에 따른 탈아미노화를 유발하여 우라실-설포네이트 형성을 초래합니다. 그러나 메틸화된 시토신 잔기는 변하지 않습니다.

다음으로, DNA에 결합 완충액을 보충하고 사전 조립된 스핀 필터 컬럼으로 옮깁니다. 완충액은 DNA가 필터에 결합하는 데 도움이 됩니다.

원심분리하여 컬럼에 갇힌 DNA에서 완충액과 중아황산염 시약 혼합물을 제거합니다. 플로우스루를 버립니다. DNA에 알칼리성 탈설포네이션 완충액을 추가합니다. 완충액은 우라실-설포네이트에서 아황산염기를 제거하여 우라실을 형성하는 데 도움이 됩니다.

원심분리하여 사용한 완충액을 제거합니다. 이제 컬럼에 용출 완충액을 추가하여 변환된 DNA를 용리합니다. PCR을 수행하여 DNA를 증폭합니다. 전환된 모든 우라실 잔기는 티민으로 증폭되는 반면, 메틸화된 시토신 잔기는 시토신으로 증폭됩니다.

증폭된 DNA의 시토신 잔기를 시퀀싱하여 샘플의 메틸화 프로파일을 생성합니다.

제조업체의 지침에 따라 중아황산염 변환 키트를 사용하여 소화된 조직의 45마이크로리터에 중아황산염 처리를 수행합니다. 샘플에 5마이크로리터의 희석 완충액을 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 한편, CT 전환 시약 1관에 증류수 750마이크로리터와 희석 완충액 210마이크로리터를 첨가하여 중아황산염 전환 시약을 준비합니다. 10분 동안 소용돌이치면서 튜브를 혼합합니다. 그런 다음 준비된 CT 변환 시약 100마이크로리터를 각 샘플에 넣고 반전으로 혼합합니다.

샘플

을 섭씨 50도의 어두운 곳에서 12-16시간 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 400마이크로리터의 결합 완충액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 각 샘플을 혼합합니다. 각 샘플을 스핀 컬럼에 넣고 컬럼을 2밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 샘플을 최대 속도로 1분 동안 원심분리하고 통과하는 흐름을 버립니다. 각 컬럼에 200마이크로리터의 세척 완충액을 추가하고 1분 동안 최고 속도로 회전시킨 다음 플로우스루를 버립니다.

각 컬럼에 200마이크로리터의 탈설화 완충액을 첨가하고 컬럼을 실온에서 15분 동안 방치합니다. 배양 후 컬럼을 최대 속도로 1분 동안 회전시키고 통과하는 흐름을 버립니다. 200마이크로리터의 세척 완충액으로 컬럼을 두 번 세척하고, 각 세척 후 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다.

각 컬럼에 46마이크로리터의 증류수를 넣고 새 멸균 1.5밀리리터 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 튜브를 2분 동안 돌려 DNA를 용리하고 컬럼을 폐기합니다. 이제 DNA를 분석할 준비가 되었습니다. 중아황산염 변형 DNA를 정량적 메틸화 특이적 PCR의 주형으로 사용하여 각 유전자 분석에서 프로모터 영역의 메틸화를 평가합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 시약을 결합하고 96웰 실시간 PCR 기기를 사용하여 열 순환 프로토콜을 실행합니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026