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암 연구
0 조회수 • 4:24 분 • April 30th, 2023
초고속 냉동 보존 기술인 유리화를 통해 살아있는 세포와 조직을 매우 낮은 온도에서 매우 오랜 기간 동안 냉각하고 보관할 수 있습니다.
갓 채취한 종양 조직을 유리화하려면 먼저 조직을 배양 플레이트에 담습니다. 종양에서 괴사 부위, 지방 함유 부위 또는 혈전을 절제합니다. 티슈를 씻어 피의 흔적을 제거하십시오.
조직을 적절한 두께의 조각으로 자릅니다. 이제 슬라이스를 DMSO 또는 디메틸 설폭사이드와 자당을 구성하는 유리화 용액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 이러한 성분은 동결 손상으로부터 세포를 보호하는 냉동 보호제 역할을 합니다.
저온에서 배양하십시오. 세포 투과성 냉동 보호제인 DMSO는 세포막을 가로질러 확산되고 세포 내 얼음 결정 형성을 방지하기 위해 세포 내 물을 대체합니다. 동시에, 비투과성 냉동 보호제인 자당은 세포 탈수를 촉진하고 세포 내 얼음 결정 형성을 감소시켜 세포 사멸 위험을 완화함으로써 세포외에서 작용합니다.
평형화된 종양 조각을 조직 홀더에 놓습니다. 그런 다음 이 어셈블리를 액체 질소로 옮겨 섭씨 영하 196도에서 얼립니다. 이러한 급속한 냉각은 조직을 유리질의 비정질 상태로 응고시키는 샘플 유리화를 초래하는 반면, 고농도의 냉동 보호제는 얼음 결정 형성 및 세포 손상을 방지합니다.
유리화된 조직은 대사 활동이 중단된 상태로 남아 있습니다.
생쥐를 안락사시킨 후 멸균 겸자와 가위를 사용하여 생쥐에서 종양을 천천히 분리합니다. DPBS와 10cm 접시에서 종양 조직을 씻습니다. 집게와 가위를 사용하여 괴사 부위, 지방 조직, 혈전 및 결합 조직을 해부하고 제거합니다.
그런 다음 금형을 사용하여 종양 조직을 최대 두께 1mm로 자릅니다. 10cm 접시에 DPBS로 종양 조각을 씻습니다. 유리화 과정을 시작하려면 집게를 사용하여 슬라이스를 튜브 V1로 옮기고 섭씨 4도에서 4분 동안 배양합니다. 튜브를 짧게 굴리고 뒤집은 다음 섭씨 4도에서 4분 더 배양합니다.
그런 다음 V1 용액과 슬라이스를 10cm 접시에 붓고 집게를 사용하여 슬라이스를 튜브 V2로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 4분 동안 배양합니다. 튜브를 짧게 굴리고 뒤집은 다음 섭씨 4도에서 4분 더 배양합니다. 그런 다음 V2 용액과 슬라이스를 10cm 접시에 붓습니다.
슬라이스를 튜브 V3로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 짧게 굴리고 뒤집은 다음 섭씨 4도에서 5분 더 배양합니다.
모든 슬라이스가 튜브 바닥으로 가라앉는지 확인하십시오. 여러 슬라이스가 떠 있는 상태로 남아 있으면 튜브를 잠시 굴리고 뒤집은 다음 모든 슬라이스가 완전히 가라앉을 때까지 섭씨 4도에서 배양합니다. 그런 다음 V3 용액과 슬라이스를 10cm 접시에 붓습니다. 티슈 홀더를 적절한 길이로 자르고 멸균 거즈 위에 놓습니다. 슬라이스를 홀더로 옮깁니다. 거즈로 홀더를 감싸십시오.
집게를 사용하여 홀더를 액체 질소에 넣고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 극저온 바이알에 조직 정보를 표시합니다. 조직 슬라이스가 있는 홀더를 액체 질소에 보관할 바이알로 옮깁니다.