Peritoneal Low-density Neutrophil Isolation: A Technique to Obtain Low-density Neutrophils from Peritoneal Lavage Fluid Using Magnetic Activated Cell Sorting(복막 저밀도 호중구 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 얻는 기술)

저밀도 호중구(LDN)는 위장관암과 같은 병리학적 상태에서 증가된 수로 발견되는 뚜렷한 호중구 하위 집단입니다. LDN은 환자의 복막강 세척액 또는 세척액에서 분리될 수 있습니다.

먼저 세척액을 여과하여 조직 잔해물을 제거합니다. 여과액을 원심분리하여 LDN을 포함한 혈액 세포를 포함하는 펠릿을 얻습니다. 적절한 완충액에 재현탁합니다. LDN 분리에 최적의 적절한 밀도 구배 매체 위에 이 현탁액을 적층

상대 밀도에 따라 다양한 혈액 성분을 분리하기 위해 원심분리합니다. 밀도가 높은 적혈구는 최하층을 형성하고 밀도가 가장 낮은 혈장 분획은 최상층을 형성합니다. 밀도가 낮은 LDN은 다른 단핵 세포와 함께 중간층을 차지합니다.

중간층을 차단 시약이 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 시약 성분은 모든 비표적 세포 표면의 비특이적 결합 부위를 차단하고 후속 라벨링 중에 LDN에 대한 특이성을 증가시킵니다.

LDN에서 과발현된 특정 세포 표면 분자를 표적으로 하는 항체 접합 마이크로비드를 추가합니다. 항체-비드 복합체가 LDN의 표적 분자에 결합하도록 배양합니다.

배양된 현탁액을 자기장에 배치된 컬럼을 통과시킵니다. 자기 영향 하에서 모든 LDN-마이크로비드 복합체는 표지되지 않은 세포가 통과하는 동안 기둥 벽에 부착됩니다.

열을 제거합니다. 적절한 완충액을 사용하여 내용물을 세척하여 LDN 함유 분획을 용출하고 수집합니다.

호중구를 획득하기 위해서는 먼저 위장관 악성종양으로 복부 수술을 받은 방금 환자의 복강에 상처 봉합 직전 생리 멸균 식염수 1리터를 직접 주입하고 복강을 최소 1분 동안 광범위하게 세척합니다. 그런 다음 공동 내에서 식염수를 저어주고 4개의 50밀리리터 주사기로 200밀리리터의 세척액을 회수합니다.

실험실에서 원심분리를 위해 100마이크로미터 나일론 필터를 통해 복막 세척액을 개별 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 0.02% EDTA가 보충된 PBS 5밀리리터에 펠릿을 재현탁하고 각 세포 현탁액을 밀도 구배 용액 3밀리리터에 조심스럽게 오버레이합니다. 밀도 구배 분리 후, 각 튜브에서 2-3밀리리터의 중간층을 수확하고 튜브당 10밀리리터의 신선한 PBS와 EDTA로 복막액 샘플을 세척합니다. 추가 세척을 위해 10밀리리터의 신선한 PBS와 EDTA에 펠릿을 붓고 세포를 자기 활성화 세포 분류(MACS) 완충액 농도 60마이크로미터당 1배 10에서 7번째 세포로 희석합니다.

섭씨 4도에서 10분 동안 20마이크로리터의 Fc 블록으로 비특이적 결합을 차단한 다음 20마이크로리터의 항-CD66b 마그네틱 비드를 추가합니다. 섭씨 4도에서 10분 후, 세포를 세척하고 500마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁한 다음 적절한 자기 분리기의 자기장 내에서 적절한 크기의 자기 컬럼에 세포를 추가합니다. 모든 CD66b 음성 세포가 컬럼을 통과하면 컬럼 저장소에 15밀리리터의 신선한 MACS 완충액을 추가하고 마그네틱 분리기에서 새 원뿔형 튜브로 컬럼을 옮깁니다. 그런 다음 즉시 컬럼을 담그고 자기 표지된 CD66b 양성을 튜브에 세척합니다.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.