호중구 세포외 트랩 또는 NET의 형광 현미경: 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 관찰하는 기술

0 조회수3:15 • April 30th, 2023

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암과 같은 병리학적 상태에서 활성화된 호중구는 순환하는 암세포를 포획하는 호중구 세포외 트랩 또는 NET(관련 효소 및 항균 단백질이 있는 세포외 DNA의 메쉬)을 방출합니다.

시험관 내에서 NET과 종양 세포 사이의 접착 상호작용을 시각화하려면 세포 부착을 촉진하는 폴리머 코팅 배양 접시에서 호중구 아형인 저밀도 호중구를 배양하는 것부터 시작합니다. 호중구를 자극하여 거미줄과 같은 NET을 형성하기 위해 몇 시간 동안 배양합니다.

적색 플루오레세인 표지 암세포의 현탁액을 호중구 배양에 첨가합니다. 암세포-NET 상호작용을 촉진하기 위해 암세포를 NET과 함께 짧은 기간 동안 배양합니다. NET-DNA는 암세포를 유인하고 NET에 대한 부착을 촉진하는 화학주성 인자 역할을 합니다.

사용한 배지를 제거합니다. 배양물을 배양물에서 부착되지 않은 종양 세포를 제거하기 위해 적절한 신선한 배지로 배양물을 부드럽게 세척합니다.

이제 막 불투과성 녹색 형광 핵 염색제를 추가하여 세포외 NET을 선택적으로 착색합니다. 형광 현미경으로 배양을 관찰하십시오. 호중구 세포외 트랩은 적색 종양 세포가 부착된 메쉬를 형성하는 녹색 끈 모양의 구조로 나타납니다

.

FBS 농도가 보충된 RPMI 1640 배지 밀리리터당 5배 10 내지 6번째 세포로 재현탁하고 6웰 폴리-L-라이신 코팅 플레이트에 웰당 호중구 1밀리리터를 시드합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 2시간 후, 제조업체의 지침에 따라 적절한 형광막 불투과성 핵 및 염색체 염료로 각 웰의 세포를 염색하고 즉시 형광 현미경으로 NET의 형태를 관찰합니다.

NET에 대한 종양 세포 부착을 평가하기 위해, 0.1% 소 혈청 알부민 농도로 보충된 RPMI 1640의 1 배 10 내지 6의 1 배로 대조 형광 염료로 염색된 위 종양 세포를 재현탁하고 저밀도 호중구 배양의 각 웰에 1 밀리리터의 종양 세포를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 5분 후, 각 웰에서 상청액을 제거하고 세척당 BSA가 보충된 예열된 RPMI 1640 배지 2밀리리터로 세포를 부드럽게 두 번 세척합니다.

5분의 배양은 NET 특이적 결합을 검출하기에 충분한 시간입니다. 따뜻한 배지를 각 웰 측면에 천천히 넣고 플레이트를 부드럽게 휘젓고 흡인기로 상청액을 제거합니다.

그런 다음 NET과 부착된 종양 세포를 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026