호중구 세포 외 트랩 또는 NET의 타임 랩스 형광 현미경 검사: 암세포와 NET 간의 접착 후 상호 작용을 분석하는 기술

암과 같은 병리학적 상태에서 활성화된 호중구는 히스톤 및 단백질 분해 효소와 관련된 세포외 DNA 섬유 네트워크인 호중구 세포외 트랩 또는 NET을 방출합니다. 이러한 구조는 암세포를 가두어 암 전이에 중요한 역할을 합니다.

시험관 내에서 NET에 갇힌 암세포의 유착 후 거동을 연구하기 위해 먼저 세포 부착을 용이하게 하는 폴리머 코팅 배양 접시에서 저밀도 호중구(호중구 하위 집단)를 배양합니다. 호중구를 활성화하여 메쉬 모양의 NET을 방출하기 위해 배양합니다.

다음으로, 막 불투과성 녹색 형광 핵 염료를 첨가하여 NET의 DNA 섬유를 특이적으로 염색합니다. 사용한 배지를 제거합니다. 호중구 배양액에 암세포 현탁액을 첨가합니다.

암세포-NET 상호작용을 촉진하기 위해 짧은 기간 동안 배양액을 배양합니다. NET의 DNA 성분은 암세포의 이동을 자극하고 NET에 대한 부착을 돕는 화학주성 인자로 기능합니다.

사용한 배지를 제거합니다. 배양 접시에서 결합되지 않은 암세포를 제거하기 위해 적절한 새 배지로 배양물을 부드럽게 헹굽니다. 신선한 세럼 함유 배지를 보충하십시오.

NET과 암세포 사이의 상호 작용 이벤트를 분석하기 위해 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 장기간 동안 배양을 이미지화합니다. 시간이 지남에 따라 NET은 암세포의 증식을 촉진하는 적절한 미세 환경을 제공합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 녹색 형광 NET에서 암세포의 증식을 관찰하십시오.

시

연된 대로 35mm 접시, 폴리-L-라이신 코팅 접시에서 복막 저밀도 호중구를 배양 및 염색한 다음 0.1% BSA 플러스 RPMI 1640 2밀리리터에서 잠시 세척합니다.

실

온에서 5분 동안 배양하기 위해 BSA가 보충된 RPMI 2밀리리터에 현탁된 10 내지 여섯 번째 염색되지 않은 위 종양 세포로 배지를 1회 교체합니다. 배양이 끝나면 BSA가 보충된 신선한 RPMI 2밀리리터로 실온에서 5분 동안 세포를 헹구고 부드럽게 소용돌이치며 부착되지 않은 종양 세포를 제거합니다.

그런 다음 상청액을 FBS와 항생제가 보충된 DMEM으로 교체하고 NET에 의한 종양 세포 포획의 시간 경과 분석을 위해 전체 보기 세포 관찰 시스템에 접시를 장착합니다.