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암 연구
0 조회수 • 3:43 분 • April 30th, 2023
엑소좀은 배양된 세포가 상청액으로 분비되는 세포외 소포 구조입니다. 엑소좀 블록을 준비하려면 먼저 엑소좀 함유 배양 상청액을 튜브에 넣습니다. 튜브를 고속으로 원심분리하여 온전한 엑소좀을 펠릿화합니다. 남은 상층액을 버립니다.
고정 완충액에 존재하는 글루타르알데히드로 엑소좀 펠릿을 처리합니다. 엑소좀의 형태를 보존하기 위해 원하는 시간 동안 얼음 위에서 혼합물을 배양합니다. 글루타르알데히드는 엑소좀에 침투하여 단백질을 가교합니다. 고정 완충액은 다운스트림 고정 과정을 위해 엑소좀을 중성 pH로 유지합니다.
글루타르알데히드 함유 완충액을 버리고 막 이중층을 투과화하고 엑소좀에 존재하는 지질을 고정하는 2차 고정제인 사산화오스뮴 용액을 추가합니다. 사산화오스뮴 용액을 제거하고 일련의 증가 농도의 아세톤으로 엑소좀을 처리합니다. 이 과정은 엑소좀을 탈수시킵니다.
절대 아세톤을 포매 배지-아세톤 혼합물로 대체하십시오. 점차적으로이 혼합물에 매입 배지의 비율을 높입니다.
엑소좀을 함유한 포매 혼합물을 원하는 금형에 붓습니다. 금형을 고온에서 오븐 건조하십시오. 이것은 엑소좀 주위에 포매 매체가 중합되어 블록을 생성합니다.
정제된 엑소좀 펠릿을 고정하려면 pH 7.0의 0.1M 카코딜레이트 나트륨 용액에 2.5% 글루타르알데히드 1밀리리터를 첨가합니다. 지질 이중층 소포를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 고정액을 제거하고 1밀리리터의 0.1M 카코딜레이트나트륨 완충액으로 실온에서 10분 동안 펠릿을 헹굽니다.
그런 다음 1밀리리터의 2% 사산화오스뮴으로 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 사후 고정합니다. 고정액을 제거하고 엑소좀 펠릿을 0.1 M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 세 번 헹구고 10분마다 완충액을 교체합니다. 그런 다음 일련의 등급이 매겨진 아세톤 농도로 각각 10분 동안 흔들어 샘플을 탈수합니다.
다음으로, 아세톤 3부와 저점도 포매 혼합물 1부의 용액을 혼합합니다. 아세톤을 이 혼합물로 교체하고 샘플을 30분 동안 배양합니다. 저점도 포매 배지의 비율을 계속 높이고 각 단계마다 30분 동안 배양합니다.
마지막으로, 엑소좀 펠릿을 저점도 포매 혼합물의 100%에 실온에서 밤새 배양합니다. 다음날 매입 금형을 사용하여 순수한 저점도 매입 혼합물에 샘플을 매립하고 섭씨 65도에서 24시간 동안 굽습니다.