Sectioning, Staining and TEM Imaging of embedded Exosomes: A Protocol to Visualize the Structural Features Using TEM (임베디드 엑소좀의 절편, 염색 및 TEM 이미징: TEM을 사용하여 엑소좀의 구조적 특징을 시각화하는 프로토콜)

엑소좀은 내강 내부에 존재하는 DNA, RNA 및 단백질 분자를 포함하는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 크기의 구형 소포입니다.

투과전자현미경(TEM)을 사용하여 엑소좀 구조를 시각화하려면 먼저 엑소좀 블록(내장된 엑소좀을 포함하는 고체 매트릭스 블록)을 사용합니다. 초마이크로톰을 사용하여 엑소좀 블록의 초박형 절편을 얻습니다.

엑소좀 단면을 적절한 그리드에 모아 표면에 부착되도록 합니다. 그리드는 후속 염색 단계를 위해 엑소좀 표본에 안정적인 지지를 제공합니다.

그런 다음 중금속 얼룩인 우라닐 아세테이트 한 방울 위에 그리드를 놓고 원하는 시간 동안 배양합니다. 우라닐 이온은 엑소좀에 존재하는 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 상호 작용합니다.

그 후, 엑소좀 생체 분자에도 결합하는 구연산 납으로 엑소좀 절편을 염색합니다. 구연산납은 사전 결합된 우라닐 이온에 약하게 결합하여 이미징 중 배경에 대한 대비를 향상시킵니다.

TEM을 사용하여 이중 염색된 엑소좀을 관찰합니다. TEM은 전자빔을 엑소좀 샘플에 집중시킵니다. 엑소좀의 염색된 영역은 염색되지 않은 영역에 비해 전자를 더 강하게 산란시킵니다.

대물렌즈 조리개는 이러한 고도로 산란된 전자를 필터링합니다. 따라서 염색된 생체 분자를 포함하는 엑소좀은 배경보다 더 어둡게 나타납니다.

울트라마이크로톰을 사용하여 두께가 60나노미터인 절편을 준비합니다. 절편을 니켈 그리드에 놓고 그 중 일부를 2% 우라닐 아세테이트로 20분 동안 이중 염색한 다음 구연산납으로 10분 동안 염색합니다. 그런 다음 염색된 절편을 투과 전자 현미경에 넣고 80kV를 사용하여 샘플을 관찰하고 노출 시간에 대한 자동 설정을 따릅니다. 엑소좀 이미지를 볼 때 현미경의 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 저장합니다.