Lamina Propria 단핵 세포 분리: 쥐 결장에서 단핵 세포를 얻기 위한 실리카 기반 밀도 구배 원심분리 기술

장 상피 아래에 위치한 장 고유층은 섬유아세포, 림프구 및 단핵구를 포함한 단핵 세포와 같은 다양한 세포를 포함하는 조밀한 콜라겐 섬유 네트워크와 함께 느슨한 결합 조직으로 구성됩니다. 이 세포는 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

단핵 세포를 분리하려면 마우스 결장 조각을 채취하는 것부터 시작하십시오. 콜라게나제 효소가 포함된 소화 완충액으로 조각을 처리합니다. 콜라게나제 효소는 조직 내의 콜라겐 섬유를 소화하여 세포를 현탁액으로 방출합니다.

상청액을 수집하고 세포 여과기를 통해 여과하여 소화되지 않은 조직과 파편을 제거하고 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 콜라게나제 효소를 비활성화하기 위해 여과액에 냉각된 완충액을 첨가합니다.

원심분리하여 세포를 분리합니다. 효소를 함유한 상청액을 버리고 세포 펠릿을 저밀도 실리카 기반 분리 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 고밀도 실리카 기반 분리 매체 위에 현탁액을 적층하여 분리 구배를 만듭니다.

혼합물을 원심분리합니다. 단핵 세포는 침전되어 밀도 구배 층 사이의 경계면에 흰색 층을 형성합니다. 흰색 계면 층을 적절한 완충액이 들어 있는 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

원심분리하여 정제된 단핵 세포를 포함하는 펠릿을 얻습니다. 추가 다운스트림 분석을 위해 펠릿을 완충액에 재현탁합니다.

시작하려면 세척된 결장 조각이 들어 있는 튜브에 콜라게나제 분해 완충액 20밀리리터를 추가합니다. 튜브를 밀봉하고 섭씨 37도에서 2 x g의 회전 속도로 60분 동안 궤도 셰이커에 넣습니다. 교반하는 동안 조직 조각이 지속적으로 움직이는지 확인하십시오.

5밀리리터의 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 3개의 개별 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브 각각에 붓습니다. 다음으로, 25밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 콜라게나제 소화 1에서 상청액만 수집합니다. 깨끗한 50밀리리터 폴리프로필렌 원추형 튜브에 넣은 40마이크로리터 기공 여과 직물 셀 스트레이너를 통해 상청액을 여과합니다. 콜라게나제 소화 완충액을 담금질하기 위해 냉각된 결장 완충액으로 튜브를 완전히 채웁니다. 그런 다음 세포를 회전시키고 상청액을 흡인한 다음 펠릿을 얼음 위에 보관합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜라게나제 분해 2를 계속 수행합니다. 콜라게나제 소화 2가 완료된 후 18G 뭉툭한 끝 바늘을 통해 튜브와 10밀리리터 주사기 사이를 앞뒤로 조직 조각을 세게 씻어냅니다. 이 세척을 최소 7-8회 반복하여 전체 조직 조각이나 파편이 보이지 않을 때까지 계속합니다.

다음으로, 깨끗한 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 넣은 40마이크로미터 기공 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 조직 분해 현탁액을 통과시킵니다. 냉각된 결장 완충액으로 튜브를 가장자리까지 채워 소화를 담금질하고 800 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.

진공 흡인을 통해 상청액을 버리고 Collagenase Digestion 1에서 재현탁된 펠릿을 해당 튜브로 당깁니다. 그 후, 각 펠릿을 결장당 44% 실리카 기반 밀도 분리 배지 24밀리리터에 재현탁합니다. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체가 들어 있는 3개의 튜브 각각에 이 배지 8밀리리터를 천천히 적층합니다.

저울이나 저울을 사용하여 원심분리기 버킷 내의 튜브의 균형을 조심스럽게 맞춥니다. 859 x g 및 섭씨 20도에서 휴식 없이 20분 동안 원심분리합니다. 튜브를 제거하기 전에 로터가 완전히 정지하도록 하고 그래디언트 인터페이스에서 셀이 방해받지 않도록 주의하십시오.

일반적으로 1-2mm 두께의 흰색 밴드가 있는 5밀리리터 표시 근처의 그래디언트 인터페이스를 시각화합니다. 피펫이 인터페이스에 더 쉽게 접근할 수 있도록 구배의 상단 7밀리리터를 진공 흡인하고 폐기합니다. 지속적인 수동 흡입과 꾸준히 회전하는 손목 움직임을 사용하여 세포의 계면층을 수집합니다. 두 구배 사이의 계면이 명확하고 굴절성이 될 때까지 수집하고 계면을 새로운 50밀리리터 폴리프로필렌 원추형 튜브로 옮깁니다.