위 안저 땀샘 격리 : 인간의 위 조직에서 기저 땀샘을 분리하는 방법

인간의 경우 안저는 위의 가장 윗부분입니다. 기저 상피는 소화를 돕는 위액을 분비하는 수많은 위선으로 구성됩니다.

위 기저선을 분리하려면 먼저 비커에 인간 기저 조직을 담아 복용하십시오. 비커에 적절한 완충액을 추가하고 기저 조직을 세게 세척합니다. 세척은 기저 조직에서 오염된 파편과 혈액을 제거합니다.

깨끗한 티슈를 페트리 플레이트로 옮깁니다. 멸균 거즈를 사용하여 보호 점액층을 닦아내어 밑에 있는 상피층을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 조직에서 최상층 상피층을 강제로 긁어냅니다.

긁은 상피를 다른 페트리 플레이트로 옮기고 더 작은 조각으로 다집니다. 다진 조각을 콜라게나제 효소가 보충된 완충액이 들어 있는 플라스크에 넣으십시오. 뭉치는 것을 방지하기 위해 일정한 교반과 함께 원하는 온도에서 배양합니다.

콜라게나제는 상피층에 존재하는 세포외 기질 단백질을 소화하여 해리된 기저선을 현탁액으로 방출합니다. 현탁액을 새 튜브에 걸러서 해리되지 않은 덩어리를 제거합니다.

전시키기 위해 땀샘 여과액을 얼음 위에 방해받지 않도록 유지하십시오. 세포 파편이 포함된 상청액을 버리고 선 침전물을 신선한 완충액에 재현탁합니다. 추가 사용이 될 때까지 선 펠릿을 원심분리하고 보관합니다.

시작하려면 칼슘/마그네슘이 없는 DPBS로 채워진 큰 플라스틱 용기에 준비된 조직을 수집합니다. 사용할 때까지 플라스틱 용기를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 집게를 사용하여 칼슘/마그네슘이 없는 DPBS 100밀리리터가 들어 있는 멸균 비커에서 약 30초 동안 조직을 세게 세척합니다. 그런 다음 멸균 거즈를 사용하여 상피에서 점액층을 닦아냅니다.

다음으로 큰 집게를 사용하여 조직의 근육층을 단단히 잡습니다. 그런 다음 큰 구부러진 지혈 겸자를 사용하여 상피를 세게 긁어냅니다. 긁힌 상피를 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 보관하십시오. 조직 소화를 최적화하려면 상피 조직을 조각으로 잘게 썬다. 그런 다음 항생제가 보충된 칼슘/마그네슘이 없는 DPBS로 조직을 세척합니다.

혈액을 제거하기 위해 여러 번 씻으십시오. 세탁물은 폐기물 비커에 버리십시오. 그런 다음 세척된 상피 조각을 25밀리리터 교반 막대와 예열된 배양 배지가 있는 125밀리리터 유리 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 조직 조각을 수집한 후 둥근 바닥 플라스크를 고무 격막으로 밀봉합니다. 그런 다음 중격에 20G 척추 바늘을 삽입합니다. 고무 호스가 있는 산소 탱크에 격막을 연결합니다.

에 10-15개의 유출 바늘을 삽입하여 파열을 방지한 다음 cl을 사용하여 설정을 링 스탠드에 고정합니다. 그런 다음 산소 유출을 낮게 켜십시오. 그런 다음 교반판에서 섭씨 37도에서 30-45분 동안 수조를 보정합니다. 보정이 완료되면 설정을 수조에 넣습니다. 배양 15분 후 해리된 땀샘이 있는지 확인합니다.

원하는 배양 시간이 지나면 혈청학적 피펫을 사용하여 예열된 DMEM/F-12 50밀리리터를 배양 배지에 첨가합니다. 다음으로, 4개의 50밀리리터 원뿔형 튜브에 멸균 거즈를 통해 얻은 샘 혼합물을 여과합니다. 그런 다음 여과액을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 이렇게 하면 글랜드가 원추형 튜브의 바닥에 정착할 수 있습니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 샘 현탁액 상단에서 상청액 40밀리리터를 버립니다.

나머지 10밀리리터의 샘 혼합물을 항생제가 보충된 DPBS 10밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 전체 혼합물을 5밀리리터 세포 배양 시험관에 분배합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 65 x g으로 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 조심스럽게 제거합니다.