닭 CAM에서 전이성 암 세포 집락 분리: 껍질이 없는 난자 배양에서 암세포를 분리하는 절차

닭 융모막 알란토막 또는 CAM은 달걀 껍질 바로 아래에 위치한 삼중 막입니다. 그것은 외부 외배엽, 혈관이 높은 중배엽 및 가장 안쪽 내배엽으로 구성됩니다.

CAM 중배엽은 혈관, 섬유아세포 및 간질 성분으로 구성되어 종양 세포 집락화에 유리한 환경을 제공합니다.

CAM에서 집락화된 암세포를 분리하려면 먼저 형광 표지된 암세포를 접시에 미리 주입한 껍질 없는 난자 배양액을 채취합니다. 형광 현미경으로 난자 배양을 시각화합니다. 형광 및 소형 전이성 암 콜로니를 찾습니다.

관심 있는 전이성 콜로니가 포함된 CAM 조직을 부드럽게 절제합니다. 절제된 CAM 조직을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 조직을 작은 조각으로 잘게 썰어 후속 단계에서 CAM이 효소 처리에 접근할 수 있도록 합니다.

튜브에 콜라게나제 효소를 보충하고 배양합니다. 콜라게나제는 CAM 중배엽의 콜라겐 단백질을 분해하고 암 콜로니 해리를 시작합니다. 현탁액을 원심분리하여 암세포, CAM 조직의 잔여물 및 CAM 섬유아세포를 펠릿화합니다. 콜라게나제 함유 상청액을 버립니다.

선택적 성장 배지를 추가하고 현탁액을 새로운 배양 플레이트로 옮깁니다. 이 배지는 다른 세포보다 부유 암세포의 성장을 촉진합니다. 암세포를 흡인하여 추가 다운스트림 분석을 위해 보관합니다.

주사 후 5일째에 인큐베이터에서 배아를 제거하고 전이성 콜로니 분포에 대한 배아 CAM을 검사하고 찾습니다. 해부 현미경 아래에서 미세한 겸자를 사용하여 관심 전이성 콜로니가 포함된 CAM 조직을 위쪽으로 부드럽게 당겨 수술용 가위로 잘라냅니다.

CAM 조직을 빈 멸균 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 튜브 뚜껑을 닫습니다. 관심 있는 모든 콜로니가 별도의 튜브에 수집될 때까지 절제 절차를 반복합니다. 각 콜로니에 대해 별도의 멸균 18G 바늘을 사용하여 미세 원심분리기 튜브에서 CAM 조직을 부드럽게 다집니다. 100마이크로리터의 1x 콜라게나제 용액을 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

세포와 CAM 조직을 300 x g으로 주변 온도에서 5분 동안 스핀다운합니다. 콜라게나제 용액을 흡인하고 관심 세포주에 대한 완전한 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 세포와 조직을 다시 회전시킵니다.

세포와 조직 조각을 1밀리리터의 완전 배지와 선택 인자(있는 경우)에 재현탁합니다. 그런 다음 단일 12웰 조직 배양 접시로 옮깁니다. 다음 1-3주 동안 암세포의 성장과 오염을 매일 모니터링하