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암 연구
0 조회수 • 3:24 분 • April 30th, 2023
혀는 층화된 편평 상피와 고유층이라고 하는 조밀한 결합 조직의 기본 층을 구성합니다. 상피는 기계적 스트레스로부터 보호하는 다층 편평 상피 세포로 구성됩니다.
상피 세포를 분리하려면 갓 수확한 쥐 혀로 시작하십시오. 더 작은 조직 조각을 얻기 위해 혀를 다집니다. 다음으로, 콜라게나제, 히알루로니다제 및 데옥시리보뉴클레아제 효소가 함유된 맞춤형 소화 칵테일로 조각을 처리합니다.
콜라게나제와 히알루로니다제 효소는 조직을 함께 유지하는 세포외 기질을 소화하여 개별 세포가 현탁액으로 방출되는 것을 촉진합니다. 데옥시리보뉴클레아제는 용해된 세포에서 방출된 유리 DNA를 분해합니다.
분해된 샘플에 혈청 함유 완충액을 첨가하여 단백질 가수분해 효소를 비활성화합니다. 이제 세포 스트레이너를 통해 샘플을 여과하여 소화되지 않은 조직 조각과 파편을 제거하고 상피 세포의 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
원심분리하여 세포를 분리합니다. 소화 혼합물을 포함하는 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁합니다. 마지막으로, 이 세포 현탁액의 원하는 부피를 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 배양을 배양합니다.
상피 세포는 배양 접시의 바닥 표면에 부착됩니다. 개별 상피 세포의 증식 능력에 따라 콜로니를 형성하기 시작합니다.
수술용 가위를 사용하여 6주 된 수컷 또는 암컷 B6 형질전환 마우스의 혀를 채취하는 것으로 시작합니다. 메스를 사용하여 조직을 매우 작은 조각으로 다진 다음 혈청이 없는 4.5밀리리터의 RPMI 일반 배지가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 조각을 모으십시오. 200마이크로리터의 삼중 효소 혼합물을 튜브에 넣고 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 10분마다 튜브를 두드려 조직의 효소 해리를 향상시킵니다. 배양이 끝나면 PBS에서 5% FBS로 반응을 중지하고 70마이크로미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 더 큰 조직 조각에서 세포를 분리합니다.
원심분리를 통해 세포를 수집하고 펠릿을 3밀리리터의 완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 60mm 접시당 3밀리리터의 완전 배지에 세포를 도금합니다. 필터 위에 남아 있는 세포 응집체를 별도의 60mm 배양 접시로 옮기고 3밀리리터의 완전 배지를 추가합니다. 뚜렷한 세포 콜로니가 형성될 때까지 두 접시를 인큐베이터에 보관합니다.
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