아가로스 겔 방울에 3D 스페로이드 내장: 다운스트림 분석을 위해 스페로이드를 보존하는 기술
0 조회수 • 2:59 분 • April 30th, 2023
스페로이드는 생체 내 종양 미세 환경을 모방하고 종양 진행을 연구하는 데 도움이 되는 3차원 시험관 내 구형 세포 응집체입니다. 포매를 통해 이러한 스페로이드를 보존하려면 먼저 원하는 완충액에 스페로이드가 들어 있는 멸균 튜브를 가져갑니다.
스페로이드를 파라포름알데히드로 처리하십시오. 파라포름알데히드는 세포 단백질을 가교하여 세포 구조를 안정화하고 보존합니다. 스페로이드를 원심분리하고 파라포름알데히드 함유 상청액을 제거합니다. 스페로이드 펠릿을 버퍼에 재현탁합니다.
다음으로, 원하는 농도의 용융 아가로스 겔 용액을 준비합니다. 현미경 슬라이드에 아가로스 겔 방울을 만듭니다. 아가로스의 응고를 방지하기 위해 가열 블록에 슬라이드를 유지하십시오.
오리피스 팁이 넓은 마이크로피펫을 사용하여 튜브에서 스페로이드를 수집합니다. 현미경 슬라이드를 건드리지 않고 스페로이드를 아가로스 겔 방울의 중앙에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 슬라이드를 적절한 온도에서 배양하여 ECM이 응고되어 내부에 스페로이드를 가두도록 합니다.
현미경 슬라이드에서 반고체 방울을 조직 카세트로 부드럽게 옮깁니다. 추가 다운스트림 분석까지 내장된 스페로이드를 에탄올에 보관합니다.
시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 첫날에 흄 후드에 스페로이드를 고정합니다. 둘째 날에는 아가로스 젤을 전자레인지의 물이 채워진 비커에 넣어 가열하고 필요할 때까지 섭씨 60도로 설정된 탁상용 가열판에서 젤을 따뜻하게 유지합니다.
세척당 얼음처럼 차가운 1X PBS 1밀리리터를 사용하여 흄 후드에서 스페로이드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 대부분의 PBS를 흡인합니다. 20마이크로리터 피펫 팁을 기울어서 자르면 더 큰 구멍이 있는 더 뾰족한 팁을 얻을
수 있습니다.그런 다음 현미경 슬라이드에 아가로스 겔 방울을 만듭니다. 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 따뜻한 가열 블록 위에 놓습니다. 수정된 피펫 팁을 사용하여 15-20마이크로리터의 부피에서 가능한 한 많은 스페로이드를 잡습니다.
현미경 슬라이드에 닿지 않도록 스페로이드를 아가로스 겔 방울의 중앙에 조심스럽게 주입합니다. 실온 또는 4도에서 5-10분 동안 배양하여 아가로스 겔 방울이 굳도록 합니다. 겔 방울이 다소 굳었지만 여전히 다소 부드러우면 메스를 사용하여 현미경 슬라이드에서 플라스틱 조직 카세트로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 티슈 카세트를 에탄올로 채워진 비커에 옮기고 실온에서 보관합니다.
개요
본 논문에서는 종양 미세환경을 모사하는 3차원 세포 응집체인 스페로이드를 임베딩하는 과정에 대해 설명합니다. 이 방법은 보존을 위해 스페로이드를 파라포름알데히드로 처리한 후, 추가 분석을 위해 아가로스 겔에 임베딩하는 과정을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 종양 미세환경
배경
- 스페로이드는 체내 종양 조건을 모방합니다.
- 세포 구조의 보존은 분석에 있어 매우 중요합니다.
- 아가로스 겔 임베딩은 스페로이드의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다.
- 임베딩 기술은 후속 응용 단계에 필수적입니다.
연구 목적
- 스페로이드를 임베딩하는 프로토콜을 제공합니다.
- 종양 진행 연구를 강화합니다.
- 세포 구조의 보존을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 파라포름알데히드를 이용한 스페로이드 처리.
- 원심분리 및 버퍼 내 재현탁.
- 매립용 아가로스 겔 준비.
- 에탄올 내 매립된 스페로이드 보관.
주요 결과
- 스페로이드 구조의 성공적인 보존.
- 아가로스 겔 내의 효과적인 임베딩.
- 프로토콜을 통한 스페로이드의 다운스트림 분석 가능.
- 임베딩 과정 중 무결성 유지.
결론
- 해당 임베딩 방법은 스페로이드 보존에 있어 신뢰할 수 있습니다.
- 종양 생물학의 추가 연구를 용이하게 합니다.
- 연구자들에게 표준화된 접근 방식을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 개요
3D 스페로이드의 무결성을 유지하는 것은 구조적 충실도가 표적 검증 및 표현형 스크리닝 결과에 영향을 미치는 종양학 약물 발견의 신뢰할 수 있는 하위 분석에 매우 중요합니다. 이 아가로스 겔 임베딩 기술은 종양 모사 모델의 안정화를 가능하게 하여, 전임상 평가에서 기전적 리스크 감소와 예측 신뢰도를 지원합니다. 이 방법은 스페로이드 구조를 유지함으로써 발견 단계부터 리드 최적화 단계까지의 중개 연속성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 스페로이드의 미세구조를 보존하여 바이오마커 및 경로 분석을 통한 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 구조적 판독값의 가변성을 줄여 실험 전반에 걸쳐 일관된 타겟 결합 평가를 지원합니다.
- 예측적 가치: 종양 관련 구조를 유지함으로써 타겟 검증 및 경로 조절 연구의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 고함량 이미징 및 생존율 분석에 적합한 표준화된 임베딩 가능 스페로이드 표본을 제작합니다.
- 운영적 가치: 취급 과정 중 스페로이드의 해리 또는 응집을 최소화하여 분석 재현성을 높입니다.
- 확장성: 병렬 화합물 스크리닝 캠페인을 위한 스페로이드의 배치 처리를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연속성: 히트 물질 발굴부터 리드 최적화까지 일관된 평가를 위해 질병 관련 3D 모델을 보존합니다.
- 기전적 리스크 감소: 스페로이드 무결성에 미치는 화합물 영향의 신뢰성 있는 평가를 가능하게 하여, 표현형 스크리닝에서 위양성 결과를 줄여줍니다.
- 전임상 일치성: 면역조직화학 염색 또는 공간 분석을 위해 온전한 조직 유사 구조가 필요한 바이오마커 연구를 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 기술은 스페로이드 형성 이후 및 분석 이전 단계의 발견 워크플로우에 통합되어, 안정적이고 보관 가능한 형태를 제공함으로써 생물학, 스크리닝 및 분석 팀 간의 신뢰할 수 있는 인계를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 하위 표현형 및 기전 분석을 위해 스페로이드 구조를 유지함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 자동화 이미징 플랫폼과 호환되는 균일하고 임베딩 가능한 스페로이드 샘플을 제공하여 분석 준비도를 향상시킵니다.
- 분석(Analytics): 처리 과정 중 구조적 손상을 방지하여 정량적 이미징 및 형태 분석을 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 전임상 단계로의 전환 시 바이오마커 검증 및 경로 분석을 위한 모델 충실도를 유지합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 종양학 프로젝트 전반에 걸쳐 재사용 가능한 보존 표준을 수립하여 방법론의 재개발 시간을 단축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 미세환경 의존적 약물 반응에 중요한 스페로이드 구조를 보존함으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 임베딩 및 에탄올 기반 보관을 통해 재현성을 향상시키고 시료 손실을 줄입니다.
- 전략적 가치: 표현형 스크리닝 데이터의 구조적 무결성을 보장하여 더 나은 go/no-go 결정을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 화합물 시리즈 전반에 걸쳐 일관되고 분석 가능한 3D 모델을 제공함으로써 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 스페로이드를 적절하게 회수하고 임베딩하기 위해서는 3D 배양 처리 및 생체 재료 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 아가로스 처리를 위해 온도 조절 장비(가열 블록, 전자레인지) 및 정밀 피펫팅 도구의 사용이 필요합니다.
- 배치 간 일관성을 보장하기 위해 팀 간 아가로스 농도와 스페로이드 로딩 부피의 표준화가 필요합니다.
- 다양한 암 모델의 스페로이드 크기 가변성이나 ECM 조성 변화에 따른 조정이 필요할 수 있습니다.
- 후속 분석에서 항원 마스킹이나 신호 소멸을 방지하기 위해, 스페로이드 라인별로 에탄올 내 보관 기간을 실험적으로 검증해야 합니다.
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마지막 업데이트: 29 8월 2026