생쥐 모델에서 세포외 기질의 제작: 쥐 혀에서 탈세포화된 혀 세포외 기질을 준비하는 효과적인 절차

조직 환경의 비세포 구성 요소인 세포외 기질 또는 ECM은 세포에서 분비되는 구조 및 조절 단백질과 다당류의 복잡한 네트워크로 구성됩니다. ECM은 세포에 구조적, 생화학적 지원을 제공하고 성장을 조절합니다.

혀 세포외 기질을 준비하려면 갓 수확한 마우스 혀를 취하는 것부터 시작하십시오. 지질층을 제거하기 위해 에탄올로 씻으십시오.

다음으로, 동결 및 해동 주기를 번갈아 가며 진행합니다. 동결은 세포 내 얼음 결정 형성을 촉진하고, 해동은 얼음 결정을 녹여 세포막을 파괴합니다.

이제 박테리아 성장을 억제하기 위해 혀를 항생제 용액에 현탁합니다. 그런 다음 고장성 식염수로 장기를 치료하십시오. 용질 농도가 높으면 세포에서 물이 흘러나와 세포가 수축합니다. 이 단계는 세포 사멸과 세포외 기질로부터의 분리를 돕습니다.

비이온성 계면활성제에서 혀를 배양합니다. 계면활성제는 세포막과 핵막을 완전히 용해시켜 세포내 내용물이 용액으로 방출되는 것을 촉진합니다.

마지막으로 칼슘과 마그네슘 이온이 함유된 용액에 혀를 현탁한 후 뉴클레아제 치료를 합니다. 칼슘 및 마그네슘 이온은 뉴클레아제의 활성을 향상시켜 용액의 유리 핵산을 분해합니다.

추가 처리가 될 때까지 탈세포화된 혀 조직을 적절한 완충액에 보관합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 안락사된 마우스로부터 혀를 분리한 후, 조직을 75% 에탄올에 3분 동안 담급니다. 그런 다음 각 혀를 10밀리몰 멸균 PBS 1밀리리터가 포함된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 용해를 수행하려면 혀를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 얼립니다. 그런 다음 조직을 실온에서 45분 동안 해동합니다. 동결-해동을 두 번 더 반복합니다.

다음으로, 75% 에탄올이 들어 있는 3.5cm 또는 6cm 배양 접시에 수술용 바늘을 사용하여 각 혀를 수술용 봉합사 조각에 넣고 작은 멸균 주석 호일 조각으로 봉합사 끝을 감습니다. 3.5cm 또는 6cm 배양 접시에 3밀리리터의 PBS를 사용하여 각 혀를 30초 동안 헹굽니다. 그런 다음 입이 넓은 병에 멸균 초순수 250밀리리터에 암피실린 밀리리터당 90마이크로그램을 준비하고 교반 막대를 추가합니다.

바닥에서 약 2cm 정도 떨어질 때까지 최대 5개의 혀를 병에 넣고 봉합사의 일부가 병 외부에 남아 있도록 캡을 조입니다. 병을 마그네틱 교반기에 12시간 동안 놓습니다. 그런 다음 배양 후, 멸균 1몰 염화나트륨에서 암피실린 밀리리터당 90마이크로그램 250밀리리터를 준비합니다. 혀와 저어 바를 병에 옮기고 뚜껑을 조입니다. 병을 마그네틱 교반기에 24시간 동안 놓습니다.

세포 용해를 수행하려면 PBS에서 멸균 2% Triton X-100 250밀리리터에 암피실린 밀리리터당 90마이크로그램을 준비합니다. 혀와 교반 막대를 병으로 옮기고 뚜껑을 조입니다. 그런 다음 병을 48시간 동안 저어줍니다. 암피실린으로 염화칼슘과 염화마그네슘을 준비한 후 티슈와 바를 병에 넣고 병을 24시간 동안 저어줍니다.

각 혀 샘플에 대해 하나의 미세 원심분리기 튜브에 HBSS에 300마이크로몰 DNase 1밀리리터를 준비합니다. 봉합사의 동일한 부분이 외부에 매달려 있는 튜브로 혀를 옮깁니다. 그런 다음 조직을 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 샘플을 암피실린이 함유된 멸균 PBS의 넓은 입 병으로 다시 옮기고 교반기에 24시간 동안 놓습니다. 배양 후, 준비된 혀 세포외 기질(TEM)을 사용할 때까지 섭씨 4도의 멸균 PBS에 보관합니다.