ECM 현탁액 제제: 조직 유래 세포외 기질에서 균질한 현탁액을 얻는 기술

조직의 복잡한 지지 네트워크인 세포외 기질(ECM)은 프로테오글리칸과 단백질로 구성됩니다.

균질화된 ECM을 얻으려면 먼저 측정량의 탈세포화된 ECM 분말을 튜브에 담아 섭취하십시오. 이제 튜브에 산성화된 완충액을 추가하여 ECM 현탁액을 형성합니다.

동시에 다른 튜브에서 해당작용 효소인 알파-아밀라아제를 동일한 산성화 완충액에 용해시킵니다. 이 완충액의 산성 pH는 알파-아밀라아제 효소의 최적 활성을 촉진합니다.

다음으로, ECM 현탁액이 들어 있는 튜브에 알파-아밀라아제 효소 용액을 보충합니다. 지속적으로 교반하면서 튜브를 배양합니다. 알파-아밀라아제는 프로테오글리칸에 존재하는 글리칸(탄수화물 부분)을 가수분해합니다.

원심분리하여 단백질이 풍부한 ECM 분획을 펠릿화하고 소화된 글리칸과 사용한 효소를 상청액에 남깁니다. 상청액을 버리십시오.

펠릿을 염화나트륨 용액에 재현탁합니다. 염화물 이온은 ECM 펠릿에서 현탁액으로 단백질을 추출합니다. 염화나트륨 함유 상청액을 원심분리하여 버립니다.

다음으로, 단백질 함유 ECM 펠릿에 아세트산을 첨가합니다. 아세트산은 ECM 단백질 응집체를 더욱 가용화하여 현탁액으로 만듭니다.

균일한 ECM 현탁액을 얻으려면 균질화기를 사용하십시오. 추가 다운스트림 분석을 위해 균질한 ECM 현탁액을 4°C에 보관합니다.

다진 ECM 또는 냉동 분쇄된 ECM 250mg의 무게를 측정하여 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 0.22몰 NaH₂PO₄ 완충액 5밀리리터를 원심분리기 튜브에 넣고 튜브에 액체 레벨을 표시합니다. 그런 다음 7.5밀리그램의 알파-아밀라아제를 1밀리리터의 0.22몰_NaH2PO₄ 완충액에 첨가하여 알파-아밀라아제 원액을 제조합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 알파-아밀라아제 원액을 샘플에 첨가합니다. 그런 다음 0.22몰_NaH2PO₄를 첨가하여 최종 부피 10밀리리터를 얻습니다. 현탁액을 300rpm 및 실온에서 72시간 동안 지속적으로 교반합니다.

현탁액을 1,500 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 소화된 ECM 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 수집하고 폐기합니다. 그런 다음 이중 증류수에 희석된 5% NaCl 10밀리리터를 사용하여 펠릿 물질을 재현탁하고 300rpm에서 10분 동안 계속 교반합니다.

펠

릿을 재현탁하기 위해 10밀리리터의 이중 증류수를 사용하기 전에 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 현탁액을 실온에서 300rpm