쥐 등뿌리 신경절과 암세포의 3차원 공동 배양 모델 구축: 신경주위 암세포 침입을 연구하기 위한 체외 모델

신경주위 침범 또는 PNI는 신경을 따라 암세포가 이동하고 그에 따라 암 성장 및 전이에 적합한 미세 환경인 신경주위로 침범하는 것을 말합니다.

시험관 내에서 PNI를 모방하려면 먼저 반구 모양이 되도록 배양 접시에 세포외 기질 또는 ECM 현탁액 한 방울을 추가합니다. 이제 배양 접시를 배양하여 3D 스캐폴드의 구조적 및 기능적 특징을 강화합니다.

다음으로, 미리 수확된 후근 신경절 또는 감각 뉴런 클러스터인 DRG를 반고체 ECM 물방울의 중앙에 조심스럽게 배치합니다. ECM 액적 내에 DRG를 포함하도록 배양합니다.

그 후, 적절한 성장 배지를 추가하고 배양합니다. 영양소가 보충된 ECM은 DRG가 비말 둘레를 향해 방사형으로 자라는 신경돌기라고 하는 작은 신경 돌기로 발아하는 데 유리합니다.

사용한 배지를 제거하여 후속 분석을 위해 ECM 액적을 준비합니다. 비말 위에 부착된 암세포를 형광으로 염색했습니다. 반구형 모양으로 인해 암세포는 물방울 주변을 따라 굴러가서 침전합니다.

암세포-신경돌기 상호작용을 허용하기 위해 배양 접시를 배양합니다. 형광 현미경으로 볼 때 암세포가 신경돌기를 따라 추적하고 DRG를 향해 이동하는 것을 볼 수 있어 신경주위 침범이 확인됩니다.

반고체 매트릭스 액적을 준비하려면 작동 현미경 아래에서 얼음에서 얼음 블록으로 유리 웰 바닥 플레이트 하나를 옮깁니다. 10마이크로리터 이하의 피펫 끝을 45도 각도로 유리 위에 직접 놓고 1.5마이크로리터의 매트릭스 방울을 유리에 조심스럽게 분배합니다. 매트릭스가 플레이트와 맞물릴 때 피펫 팁을 유리에서 천천히 멀리 이동합니다.

플레이트의 네 모서리 각각에 매트릭스 한 방울을 증착하고 플레이트를 실온 표면에 약 1분 동안 옮깁니다. 매트릭스가 약간 뻣뻣해지면 플레이트를 얼음 블록으로 되돌리고 닫힌 현미경 겸자를 사용하여 왼손으로 DRG를 부드럽게 퍼냅니다.

오른손을 사용하여 신경 조직을 21G 바늘 끝으로 조심스럽게 옮기고 바늘을 사용하여 DRG를 기질 방울 중앙에 부드럽게 삽입합니다. DRG는 바늘로 중앙 위치를 지정하기 위해 매트릭스로 쉽게 풀려야 합니다.

4개의 물방울 각각에 DRG 조각을 삽입한 후 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 3분 동안 넣습니다. 모든 DRG가 매립되면 플레이트를 한 번에 하나씩 약간의 각도로 잡고 10% FBS가 보충된 DMEM 4밀리리터를 플레이트에 천천히 첨가하여 배지가 매트릭스-DRG 장치와 점차적으로 접촉하도록 합니다.

플레이트를 인큐베이터에 48-72시간 더 돌려 놓습니다. 신경돌개가 매트릭스 가장자리까지 최소 75%에 도달하면 매트릭스-DRG 장치를 제거하지 않고 웰에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 부드러운 트리거가 있는 200마이크로리터 피펫을 사용하여 각 매트릭스 DRG 분석 위에 배지 밀리리터당 3 x 10 5번째 세포에 2방울을 떨어뜨리고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 1시간 후, 유리 바닥 플레이트의 측벽을 따라 10% FBS가 함유된 DMEM 4밀리리터를 부드럽게 추가하고 다음 현미경 평가까지 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.