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종양에는 측면 집단으로 알려진 줄기 유사 세포의 작은 부분이 포함되어 있습니다. 이 세포는 화학 저항성이 있어 암 재발의 원인이 됩니다.
암세포의 측면 집단을 분리하려면 먼저 형광 염료 용액인 Hoechst를 암세포 현탁액이 들어 있는 바이알에 첨가합니다. 정상 암세포 내부에서 Hoechst 분자는 핵으로 들어가 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하여 이러한 세포에서 높은 형광을 유발합니다.
대조적으로, 측면 집단에는 세포에서 염료 분자를 빠르게 제거하는 유출 펌프인 고농도의 ABC 수송체가 포함되어 있습니다. 염료 분자의 이러한 활성 유출은 측면 집단을 낮은 강도로 형광으로 만듭니다.
이제 Hoechst로 처리된 암세포의 다른 바이알을 가져다가 Verapamil을 추가합니다. 이 바이알은 Verapamil이 ABC 수송체를 차단할 때 대조군 역할을 합니다. 이 단계는 Hoechst 유출을 감소시키고 측면 집단 세포 내부에 염료를 유지합니다.
다음으로, 요오드화 프로피듐을 사용하여 두 바이알의 세포를 대조염색합니다. 요오드화 프로피듐은 죽은 세포의 핵에만 들어가 DNA 염기 사이에 삽입됩니다. 이것은 죽은 세포에서 높은 형광으로 이어집니다.
마지막으로 형광 활성화 세포 분류기 또는 FACS를 사용하여 세포를 분류합니다. FACS는 형광성이 높고 Hoechst 유지 종양 세포와 죽은 세포를 형광이 낮은 쪽 집단 세포에서 분리합니다.
Hoechst 염료 유출 분석법으로 암 줄기 유사 세포의 측면 집단을 선택하려면 먼저 하나의 원뿔형 튜브를 "Hoechst"로 표시하고 다른 하나를 "Hoechst 및 Verapamil"로 표시합니다. 다음으로, 멸균 PBS로 HNSCC 세포 배양물을 세척한 다음 트립신-EDTA 1밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 3분 후 신선한 세포 배양 배지와의 반응을 멈추고 세포를 계수합니다. 배양액을 완전한 부모 세포주 배지에서 밀리리터당 10 내지 7번째 세포의 1배로 희석합니다.
그런 다음 "Hoechst 및 Verapamil" 튜브에 100마이크로리터를 넣고 "Hoechst" 튜브에 4밀리리터의 세포를 추가합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 5밀리몰 베라파밀 염산염 용액을 "Hoechst 및 Verapamil" 샘플에 부드럽게 혼합한 다음 10배당 5마이크로리터의 Hoechst를 양쪽 튜브의 여섯 번째 세포에 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도에 놓습니다. 15분마다 부드럽게 혼합하여 90분 후, 튜브를 원심분리하고 펠릿을 PBS 2밀리리터에 재현탁합니다.
두 번째 원심분리 후, "Hoechst 및 Verapamil" 펠릿을 PBS의 요오드화 프로피듐 500마이크로리터에 재현탁하고 "Hoechst" 펠릿을 4밀리리터에 재현탁합니다. 이제 70미크론 세포 스트레이너를 통해 FACS 튜브로 샘플을 필터링하여 응집체를 제거하고 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 그런 다음 "Hoechst" 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 유세포 분석기 소프트웨어에서 "글로벌 워크시트" 창을 엽니다. "Dot Plot"을 클릭하여 전역 워크시트에 그래프를 만들고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 정방향 및 측면 분산 매개변수를 선택합니다.
같은 방법으로 측면 산란 높이 도트 플롯으로 측면 산란을 만든 다음 "Polygon Gate"를 클릭하여 두 번째 그래프에 P1 영역을 생성하여 단일 셀을 선택하고 이중선을 구별합니다. 그런 다음 파란색 Hoechst 영역 도트 플롯으로 빨간색 Hoechst 영역을 만들고 셀을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 P1 모집단을 강조 표시합니다. 그런 다음 P2 영역을 생성하여 세포의 주요 집단의 왼쪽에 보조 무기로 나타나는 세포의 음성 Hoechst 염료 측 집단을 선택하고 "Hoechst" 샘플 이벤트 10,000개를 수집합니다.
측면 모집단을 나타내는 P2 게이트가 올바르게 배치되었는지 확인하려면 10,000개의 "Hoechst 및 Verapamil" 샘플 이벤트도 수집합니다. 측면 인구는 사라져야 합니다. 그런 다음 Hoechst 염료 음성 세포의 측면 집단을 1밀리리터의 완전한 암 줄기 유사 세포 배지가 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 분류합니다. 분류가 끝나면 세포를 회전시키고 측면 집단 펠릿을 1밀리리터의 신선한 완전 암 줄기 유사 세포 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포의 수를 계산하고 적절한 수로 새 세포 배양 플라스크에 파종합니다.