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암 연구
0 조회수 • 5:22 분 • April 30th, 2023
종양에는 측면 집단으로 알려진 줄기 유사 세포의 작은 부분이 포함되어 있습니다. 이 세포는 화학 저항성이 있어 암 재발의 원인이 됩니다.
암세포의 측면 집단을 분리하려면 먼저 형광 염료 용액인 Hoechst를 암세포 현탁액이 들어 있는 바이알에 첨가합니다. 정상 암세포 내부에서 Hoechst 분자는 핵으로 들어가 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하여 이러한 세포에서 높은 형광을 유발합니다.
대조적으로, 측면 집단에는 세포에서 염료 분자를 빠르게 제거하는 유출 펌프인 고농도의 ABC 수송체가 포함되어 있습니다. 염료 분자의 이러한 활성 유출은 측면 집단을 낮은 강도로 형광으로 만듭니다.
이제 Hoechst로 처리된 암세포의 다른 바이알을 가져다가 Verapamil을 추가합니다. 이 바이알은 Verapamil이 ABC 수송체를 차단할 때 대조군 역할을 합니다. 이 단계는 Hoechst 유출을 감소시키고 측면 집단 세포 내부에 염료를 유지합니다.
다음으로, 요오드화 프로피듐을 사용하여 두 바이알의 세포를 대조염색합니다. 요오드화 프로피듐은 죽은 세포의 핵에만 들어가 DNA 염기 사이에 삽입됩니다. 이것은 죽은 세포에서 높은 형광으로 이어집니다.
마지막으로 형광 활성화 세포 분류기 또는 FACS를 사용하여 세포를 분류합니다. FACS는 형광성이 높고 Hoechst 유지 종양 세포와 죽은 세포를 형광이 낮은 쪽 집단 세포에서 분리합니다.
Hoechst 염료 유출 분석법으로 암 줄기 유사 세포의 측면 집단을 선택하려면 먼저 하나의 원뿔형 튜브를 "Hoechst"로 표시하고 다른 하나를 "Hoechst 및 Verapamil"로 표시합니다. 다음으로, 멸균 PBS로 HNSCC 세포 배양물을 세척한 다음 트립신-EDTA 1밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 3분 후 신선한 세포 배양 배지와의 반응을 멈추고 세포를 계수합니다. 배양액을 완전한 부모 세포주 배지에서 밀리리터당 10 내지 7번째 세포의 1배로 희석합니다.
그런 다음 "Hoechst 및 Verapamil" 튜브에 100마이크로리터를 넣고 "Hoechst" 튜브에 4밀리리터의 세포를 추가합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 5밀리몰 베라파밀 염산염 용액을 "Hoechst 및 Verapamil" 샘플에 부드럽게 혼합한 다음 10배당 5마이크로리터의 Hoechst를 양쪽 튜브의 여섯 번째 세포에 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도에 놓습니
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