메틸 티아졸릴 테트라졸륨 또는 MTT 분석법: 암세포의 대사 활성을 측정하여 약물 내성을 측정하기 위한 비색 분석

메틸 티아졸 테트라졸륨 또는 MTT 분석을 통해 세포 대사 활동 측정을 기반으로 세포 생존율을 평가할 수 있습니다.

분석을 시작하려면 관심 약물의 농도 증가 범위를 준비하십시오. 동일한 부피의 서로 다른 약물 농도를 멀티웰 플레이트의 웰에 추가합니다.

다음으로, 원하는 약물 민감성 부모 암세포 및 이들의 약물 내성 변이체의 현탁액을 적절한 배지에 피펫팅하고, 각각 상이한 약물 농도를 포함하는 웰 세트에 넣습니다. 플레이트를 배양합니다.

배양에서 약물에 민감한 암세포는 약물 분자에 민감하여 낮은 농도에서도 세포 사멸을 초래합니다. 반대로, 약물 내성 암세포는 약물 분자에 둔감하여 약물 농도가 높은 경우에도 생존과 증식을 촉진합니다.

MTT 용액으로 세포를 처리하고 배양합니다. 양전하를 띤 테트라졸륨 염인 MTT는 대사 활성 세포에 쉽게 침투합니다. 이 세포 내에서 NAD(P)H 의존성 산화환원효소 효소는 MTT 염을 수불용성 포르마잔 결정으로 환원시켜 세포 표면으로 운반됩니다.

이제 적절한 가용화 용액을 웰에 추가합니다. 잘 섞어 포르마잔 결정을 유색 용액에 녹입니다. 마지막으로 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 세포 대사 활동을 나타내는 유색 용액의 흡광도를 측정합니다.

약물 내성 암세포가 포함된 우물은 더 높은 색상 강도를 나타내며, 이는 약물 민감성 암세포에 비해 세포 생존력이 증가했음을 시사합니다.

96웰 평평한 바닥 실험 플레이트를 준비합니다. 세포를 제어하고 세포가 없는 배지를 제어하기 위해 약물 농도에 웰을 전용합니다. 덱사메타손 또는 덱스의 약물 희석 범위를 준비합니다. 각 Dex 희석액에서 30마이크로리터를 96웰 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 각 농도를 세 번으로 포함해야 합니다.

기하급수적으로 성장하는 백혈병 세포를 수확하고 최적의 파종 농도로 재현탁합니다. 약물 용액 또는 성장 배지를 포함하는 각 웰에 120마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 72시간 동안 배양합니다. 배양 단계 후, 반복 피펫을 사용하여 각 웰에 15마이크로리터의 MTT 시약을 추가합니다.

접시 셰이커로 접시를 분당 최대 5회 흔들어 5분 동안 최대 900회 흔듭니다. 플레이트를 5% 이산화탄소와 세포 배양 인큐베이터가 있는 섭씨 37도에 다시 놓고 4-6시간 더 배양합니다.

배양 후, 흡광도 값은 화합물의 적절한 가용화에 따라 달라지므로 포르마잔 결정을 완전히 재현탁해야 합니