마그네틱 비드 기반 엑소좀 추출: 생체 유체에서 특정 엑소좀을 분리하는 기술

0 조회수4:03 • April 30th, 2023

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엑소좀은 세포에서 생체액으로 분비되는 세포외 소포 구조입니다. 생체액에서 특정 엑소좀을 포획하려면 먼저 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드를 튜브에 넣으십시오.

이 튜브에 비오티닐화된 항인간 항체를 첨가합니다. 항체에 존재하는 비오틴은 마그네틱 비드에 존재하는 스트렙타비딘에 대해 높은 친화력을 갖습니다. 그 결과 항체가 마그네틱 비드와 접합됩니다.

다음으로, 항체 표지 마그네틱 비드가 들어 있는 튜브에 단백질이 풍부한 차단 용액을 추가합니다. 차단 용액의 단백질은 마그네틱 비드의 자유 부위에 결합하여 엑소좀 결합의 특이성을 증가시킵니다.

이제 엑소좀이 풍부한 샘플 생체액으로 튜브를 보충합니다. 교반하면서 튜브를 배양합니다. 생체액의 엑소좀은 특정 표면 수용체를 나타내며, 이는 자기 구슬 표면에 부착된 항체에 결합하는 데 도움이 됩니다.

다음으로 튜브를 자기장에 놓습니다. 자기장의 영향으로 엑소좀 결합 자기 구슬이 튜브 표면에 부착됩니다. 그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 튜브에서 남은 생체액을 흡인합니다.

마지막으로 자기장에서 튜브를 제거하고 적절한 완충액을 추가하여 엑소좀 결합 비드를 용리합니다. 이러한 엑소좀 결합 비드는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

스트렙타비딘으로 코팅된 자성 미립자 밀리리터당 10마이크로그램을 함유한 원액을 재현탁하고 495마이크로리터의 PBS가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 5마이크로리터의 용액을 첨가합니다. 구슬을 세척하려면 먼저 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 구슬을 방해하지 않고 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 튜브를 비자성 선반으로 옮깁니다. 500마이크로리터의 PBS를 넣고 피펫으로 비드를 세척합니다. 이 작업을 총 세 번 수행합니다. 최종 세척 후, 비드를 490마이크로리터의 PBS에 재현탁한 다음 밀리리터당 1밀리그램의 원액에서 5마이크로리터의 비오티닐화된 마우스 항인간 CD63 항체를 첨가합니다.

피펫팅으로 용액을 혼합합니다. 90도 회전을 5초 동안 회전하고 5도 진동을 1초 동안 샘플 회전기를 프로그래밍합니다. 튜브를 회전 장치에 넣고 실온에서 30분 동안 프로그램을 실행합니다.

그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 옮깁니다. 비드를 500마이크로리터의 PBS로 세 번 세척한 다음 카제인을 함유한 490마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 샘플 식별이 있는 튜브에 라벨을 붙인 다음 샘플 10마이크로리터를 추가합니다.

펫팅을 여러 번 하여 샘플을 항체 접합 비드와 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 샘플 회전 장치로 옮기고 실온에서 2시간 동안 동일한 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 자화 랙을 사용하여 500마이크로리터의 1M Tris-Hydrochloride 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다. 엑소좀은 이제 자화된 비드에 결합됩니다.

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